FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA DEL VINO
- Lías compactas: Las lías, que se encuentran en el fondo del tanque, pueden compactarse como resultado de la presión hidrostática, hasta el punto de que las levaduras, bacterias y nutrientes se encuentren atrapados y no realicen sus funciones.
La presión hidrostática era P= d x g x h siendo d=densidad del líquido y g = gravedad, ambas constantes, por lo que la variación de la presión hidrostática dependerá de h= altura.
Los tanques con mayor altura podrían relacionarse con retrasos del inicio de la fermentación maloláctica, ya que al haber más presión hidrostática, los nutrientes están compactados y, por tanto, no disponibles para las bacterias malolácticas.
Para evitar el retraso de la fermentación maloláctica, en los tanques grandes, se pueden realizar remontados, sobre todo, si se realizan inóculos de bacterias. En este caso, se debe remontar el mismo día del inóculo o bien al día siguiente. Y, posteriormente, es recomendable remover las lías regularmente, al menos una vez a la semana, para asegurar que las bacterias y los nutrientes se mantengan en suspensión.
- Cantidades excesivas de Oxígeno: Las bacterias malolácticas son microaerófilas, por tanto, una cantidad excesiva de oxígeno dificultará su desarrollo. Tampoco poseen metabolismo oxidativo ya que carecen del sistema citocromo y catalasa, por consiguiente, el oxígeno no lo pueden utilizar y su presencia impedirá el desarrollo del metabolismo fermentativo. Esto significa que la exposición de las bacterias a cantidades elevadas de oxígeno una vez completada la fermentación alcohólica debería ser evitada.
Una aireación antes de la fermentación maloláctica debería ser evitadas y la microoxigenación, en principio, si es muy, muy ligera podría ayudar por el efecto de removido que tiene, y puesto que las bacterias malolácticas son microaerófilas, esta práctica podría resultar beneficiosa. Además esta técnica favorece la polimerización y estabilización de los antocianos con los taninos, antes de que se desarrolle la fermentación maloláctica y cause una disminución de la intensidad de color.
En la fotografía podemos observar una Placa de Petri con un medio de cultivo específico para el crecimiento de bacterias lácticas. Se aprecian varias colonias de color claro, que contrastan con el color marrón del medio de cultivo.
- Residuos de fungicidas: Los residuos de algunos fungicidas y pesticidas y, sobre todo, los compuestos sistémicos, utilizados frecuentemente en temporadas húmedas para controlar el hongo de la botrytis, pueden ser tóxicos para las bacterias malolácticas. La recomendación sería concienciar y exigir a los productores que respetaran los plazos de seguridad establecidos para los diferentes productos utilizados.
- Concentración inicial de ácido Málico: Principalmente, la climatología, algunas prácticas vitícolas y la variedad de uva condicionan los contenidos en ácido málico de la uva. Así, veranos frescos y riegos excesivos, aumentan el contenido de ácido málico en la misma. Es curioso que, cuanto más necesario se hace realizar la fermentación maloláctica, más difícil lo es para la bacteria láctica, ya que no resiste los altos niveles de acidez.
- Presencia de CO2: Pequeñas dosis de anhídrido carbónico favorecen el desarrollo de las bacterias lácticas.
- Presencia de ácidos grasos: Los ácidos grasos de cadena media, entre los que destacan, caproico, hexanoico y dodecanoico, derivados del metabolismo de las levaduras, podrían dificultar la fermentación maloláctica.
NUTRIENTES
- El ácido málico es poco rentable energéticamente para la bacteria láctica:
El ácido málico es utilizado como fuente de carbono por las bacterias malolácticas. Pero, en realidad la transformación maloláctica, en sí, aparece como energéticamente desfavorable para las bacterias malolácticas. Proporciona poca energía libre (AG =-8,3 kJ/mol).
Además de proporcionar poca energía para el crecimiento celular, tampoco proporciona una fuente de carbono para las reacciones biosintéticas esenciales para el desarrollo celular. Pero, aún así, la fermentación maloláctica ha demostrado, de hecho, proporcionar energía en forma de ATP a las células bacterianas.
- Mecanismo que utiliza la bacteria maloláctica para obtener ese ATP:
La bacteria maloláctica logra obtener ese ATP gracias a un mecanismo quimiosmótico que genera fuerza motriz de protones a través de la membrana celular, durante las tres fases diferenciadas de la fermentación maloláctica:
1. Primera fase: Entrada del ácido L-málico dentro de la célula bacteriana, facilitada por un transportador enzimático específico, (la permeasa del ácido málico).
2. Segunda fase: Una vez que el ácido málico ha entrado en el interior de la bacteria maloláctica, el ácido L-málico es descarboxilado dentro de la célula, por la enzima maloláctica, produciendo ácido L-láctico y CO2, lo que provoca, como ya sabes, un aumento del pH intracelular.
3. Tercera fase: El ácido L-láctico y CO2 son expulsados de la célula.
Por cada molécula de ácido láctico que sale de la célula, de la bacteria maloláctica, un protón también se desplaza fuera de ella. Esto establece un gradiente de protones, a través de la membrana celular, en concreto, entre el citoplasma y el medio que la rodea, en este caso el vino.
- La bacteria láctica crea un gradiente de protones para conseguir energía disponible en forma de ATP:
El gradiente, combinado con una ATP-asa específica en la membrana celular de la bacteria, que hace de nuevo posible la entrada de esos protones al interior celular, facilita la generación de energía disponible en forma de ATP.
La síntesis de un ATP requiere la entrada de tres protones a través de la ATP-asa presente en la membrana.
Para conseguir 1 ATP, hacen falta tres moléculas de ácido málico, ya que, por cada molécula de ácido láctico que sale de la bacteria, un protón también se desplaza fuera de ella, y la síntesis de un ATP requiere la entrada de tres protones, que, previamente, habían salido del medio interno de la bacteria al medio externo.
- La bacteria maloláctica utiliza el ácido málico:
Las bacterias malolácticas necesitan los azúcares como fuente de carbono, es decir, como fuente de energía. Pero, cuando finalizada la fermentación alcohólica, apenas disponen de ellos, salvo algún resto de hexosas y las ya mencionadas pentosas.
Aunque los ácidos málico y, también ácido cítrico, no son suficientes como única fuente de energía para el crecimiento de las bacterias malolácticas; en condiciones de disponibilidad mínima de azúcar (como la que presenta el vino una vez finalizada la fermentación alcohólica), o también en situación de pH bajo, condiciones que inhiben el metabolismo celular; las bacterias lácticas se ven obligadas a utilizar dichos ácidos como fuente de carbono para obtener energía. Esa energía (ATP), generada por la fermentación maloláctica, les será útil para su crecimiento y desarrollo celular, aunque el proceso no les sea rentable.
Es decir, es el último remedio de las bacterias malolácticas para poder sobrevivir y de paso al vino, le hacen un favor organoléptico. En realidad, es un mecanismo de supervivencia, un acto "inteligente" de un ser vivo.
PH
El pH es una medida de la concentración de iones H+ que se hallan presentes en un medio. Los compuestos de los que provienen esos iones H+, son los ácidos, sustancias capaces de ceder esos iones H+ al medio. Se les denomina ácidos fuertes a aquellos que se disocian fácilmente (es decir que ceden los iones H+ al medio) y, ácidos débiles, a aquellos que no se disocian tan rápidamente o no lo llegan a hacer.
Su fórmula es: pH= -log [H+]
Su valor nos indicaba la acidez real del medio, en nuestro caso, del vino. El pH del vino determina las especies bacterianas que crecerán; la viabilidad, la velocidad de crecimiento y la selección de las bacterias malolácticas, así como, la velocidad de degradación del ácido málico y el comportamiento metabólico de las especies bacterianas.
La bacteria maloláctica que más resiste la acidez es, Oenococcus oeni.
A pH mernor de 3 el crecimiento de las bacterias malolácticas será será muy lento y a pH cercano a 4 será muy rápido.
Los principales ácidos del vino:
- Ácido tartárico: No es atacado por las bacterias lácticas, salvo enfermedad. La variación en el vino puede provenir de su insolubilidad ya que forma sales tártricas que precipitan.
- Ácido málico: Está presente naturalmente en la forma L-Málico. El ácido D-málico no se encuentra presente de forma natural en el zumo de uva y no es metabolizado por las bacterias lácticas del vino.
- El crecimiento de bacterias inducido por el ácido málico: Diversos estudios dicen que, Oenococcus oeni, presenta el llamado, crecimiento inducido del ácido málico. Consiste, en que durante el crecimiento a pH bajo, las bacterias malolácticas degradan el ácido málico a velocidad elevada, mientras que los carbohidratos son degradados con un ritmo lento (el metabolismo de los carbohidratos a pH bajo se encuentra inhibido). Este fenómeno produce un aumento global del pH que, en sí mismo, permite una mejor adaptación de Oenococcus oeni al medio. Este hecho, permitirá una mayor utilización de los carbohidratos presentes, por Oenococcus oeni y, por tanto, la obtención de ATP, que lo utilizará para su desarrollo y reproducción, incrementándose así, el número de células bacterianas.
- Ácido cítrico: El ácido cítrico es un compuesto importante del mosto de uva y del vino y se puede encontrar en concentraciones que van de 0,1 a 0,7 g/L. El metabolismo del ácido cítrico, en Oenococcus oeni, está relacionado con la síntesis de ácido acético, diacetilo, acetoína y 2,3 butanodiol. Oenococcus oeni no es capaz de crecer teniendo sólo el ácido cítrico como única fuente de carbono y de energía. Una vez degradado el ácido málico, comienzan con el ácido cítrico, se trata de sobrevivir, por eso no es conveniente acidificar un mosto con ácido cítrico.
NIVEL DE SULFUROSO
Si no deseas que se realice la fermentación maloláctica, finalizada la fermentación alcohólica, una de las intervenciones que debes hacer es sulfitar el vino. Por otro lado, si deseas realizar la fermentación maloláctica, no debes sulfitar el vino y debes controlar que la fermentación maloláctica se lleve a cabo adecuadamente y, por añadidura, hay que estar muy atento a que finalice la fermentación maloláctica, para sulfitar de inmediato, y poner el vino a un nivel de 25-30 ppm de sulfuroso libre.
Se debe sulfitar de inmediato, una vez finalizada la fermentación maloláctica, o según algunos expertos, cuando está prácticamente finalizada, en concreto cuando queda 0,5 gr/l de ácido málico. Para que las bacterias malolácticas, no ataquen otros sustratos que produzcan metabolitos no deseados. Cómo puede ser el ácido cítrico que al ser atacado eleva, especialmente, la acidez volátil.
- El sulfuroso es un ácido, cuya fórmula química es H2SO3, resultado de la unión del anhídrido sulfuroso SO2 y el agua (H2O) y, que según su grado de disociación, lo encontraremos en las siguientes formas moleculares: ión bisulfito (HSO3); ión sulfito (SO3); anhídrido sulfuroso (SO2) y sulfuroso (H2SO3). El grado de disociación dependerá del pH del vino.
Del sulfuroso libre la parte activa es la forma molecular SO2. Se encuentra en una pequeñísima proporción, pero es suficiente para ejercer su acción. Esta proporción se puede calcular con la siguiente fórmula: SO2 molecular (%) = 100/[10 pH-1,81 + 1].
Esto significa que una parte del sulfuroso añadido al mosto, aunque queda libre, no es activo y, además, otra parte del sulfuroso añadido, se combina y tampoco será activo. Los compuestos con los que se combina son aquellos que tienen grupos ceto (–C=0).
- El SO2 molecular actúa en las bacterias malolácticas presentando una acción inhibitoria sobre las enzimas citoplasmáticas, parando el crecimiento bacteriano.
- Nivel de sulfuroso qu se precisa: Se desarrollan con dificultad a partir de 100 mg/L sulfuroso SO2 total y a partir de 10 mg/L de sulfuroso SO2 libre. (Debemos tener en cuenta que estos valores son relativos ya que dependen del pH; éste determina el grado de disociación del sulfuroso, de tal manera, que cuanto más bajo sea el pH, más SO2 molecular presentará el vino).
Pero no todas las bacterias malolácticas resisten de igual manera al sulfuroso. La resistencia depende de la de las especies y de las cepas bacterianas. Así, por ejemplo, Pediococcus danmnosus dentro del rango de los vinos, es insensible, pero esta bacteria, si todo se hace adecuadamente, no la tendremos presente en el vino. La que debe estar presente es Oenococcus oeni que está adaptada tanto, por vía natural, como por selección comercial, a resistir mayor nivel de sulfuroso.
Además, las bacterias metabolizan acetaldehído, el cual, puede estar combinado con el sulfuroso, por lo que el SO2 combinado también les resulta tóxico, aunque sea 5-10 veces menos activo que el SO2 libre.
NITRÓGENO FÁCILMENTE ASIMILABLE
Las BML (bacterias malolácticas) son golosas y exigentes en su nutrición, no en vano, requieren una dotación amplia de aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas y minerales.
- Los aminoácidos, fuente principal de nitrógeno para las bacterias malolácticas:
Las bacterias malolácticas necesitan una fuente de nitrógeno para su crecimiento y desarrollo. El nitrógeno forma parte del grupo amino-NH2 de los aminoácidos, y éstos forman las proteínas.
La fuente principal de nitrógeno para las bacterias malolácticas son los aminoácidos. Los requisitos de aminoácidos específicos varían según la cepa de bacteria maloláctica. Diversos estudios realizados en aislados de Oenococcus oeni y Pediococcus pentosaceus del vino, se ha comprobado que podrían requerir para su desarrollo hasta 16 aminoácidos diferentes, lo que demuestra la importancia de los mismos.
Las bacterias malolácticas no pueden usar fuentes de nitrógeno inorgánico tales como fosfato diamonio. Ellas precisan del nitrógeno amino de los aminoácidos. En las levaduras, el amonio es la forma de nitrógeno más fácilmente asimilable, y lo pueden tomar del fosfato diamonio. Por tanto, la utilización del nitrógeno marca la diferencia entre levaduras y bacterias.
- Las cantidades de nitrógeno que necesita Oenococcus oeni:
Las cantidades requeridas de cada uno de los aminoácidos, según los diferentes estudios, han sido confirmados, y es suficiente el equivalente de menos de 2 mg N/L para asegurar el crecimiento de Oenococcus oeni.
El vino dispone de los aminoácidos suficientes. La autolisis de las levaduras era fuente de compuestos nitrogenados. Principalmente, son péptidos y manoproteínas de la pared celular. Pero estos compuestos están en el medio y para que las bacterias malolácticas lo utilicen deben penetrar a su interior.
- Cómo llevan acabo la asimilación:
Estudios de secuenciación del genoma de Oenococcus oeni han descubierto la presencia de genes que podrían, potencialmente, codificar para las enzimas proteasas y peptidasas, así como para transportadores de péptidos y de aminoácidos. De esta manera, la bacteria maloláctica dispone de la maquinaria suficiente, primero, para romper proteínas y péptidos y, luego, para pasar péptidos y aminoácidos del vino al interior de la bacteria y poder ser utilizados.
Las bacterias malolácticas son golosas y exigentes en su nutrición. Y eso es porque además del nitrógeno amino, las bacterias malolácticas del vino deben ser abastecidas de purinas y pirimidinas o de sus derivados, ya que tienen un efecto estimulante sobre su crecimiento.
Varias vitaminas del grupo B son esenciales para el crecimiento y, al parecer, todas las cepas requieren ácido fólico y ácido nicotínico.
Respecto a los minerales, los diversos estudios realizados confirman que, potasio, sodio, magnesio y cantidades relativamente elevadas de iones manganeso, son necesarios para el crecimiento de bacterias malolácticas. La concentración de todos estos iones en el vino es, generalmente, suficiente para permitir el crecimiento y el metabolismo de las bacterias lácticas.
Una vez en el interior de la bacteria, los AA, a veces, sufren transformaciones no deseadas como las descarboxilaciones de la histidina, de la arginina y de la lisina. La histidina da lugar a la formación de aminas biógenas, tales como la histamina, que es una sustancia alérgena. La arginina origina ornitina, que es un inhibidor microbiano, de la que se derivan cadaverina y putrescina de olor a carne podrida y el carbamato de etilo que es una sustancia de supuestas propiedades cancerígenas. De la lisina se forma el 2-acetil tetrahidropiridina, de característico olor a ratón. Por fortuna, on un buen control de los factores que nos influyen en la fermentación maloláctica y la utilización de una cepa comercial, esto se puede evitar.
SANIDAD
Primero, la uva, después, el mosto y, más tarde, el vino, constituyen un medio donde se instalan diferentes microorganismos. Con esta reflexión y según las condiciones y los recursos que presente un medio, se adaptarán y sobrevivirán unos u otros microorganismos. Si las condiciones son inhóspitas para algunos de ellos, éstos morirán; aquellos que tengan condiciones de desarrollo similares, entablarán una lucha por la supervivencia y, por tanto, una competencia por los recursos
Desde el punto de vista enológico, nos interesa que estén los microorganismos beneficiosos, como las levaduras y, dentro de ellas, las especies más interesantes. De igual manera deberemos evitar aquellos que resultan perjudiciales como son el hongo Botrytis y las bacterias acéticas, entre otros.
Por tanto, es muy importante la sanidad de la uva. Una uva con Botrytis es una uva con bacterias acéticas, con enzimas oxidativas, con menor cantidad de azúcares, con menor contenido en nitrógeno, con muchas especies de bacterias lácticas, con mayor cantidad de levaduras apiculatas, etc. En definitiva, un panorama nada interesante y, de cualquier manera, una situación que siempre hay que evitar, como tú bien sabes.
Los microorganismos perjudiciales van a restar recursos a los beneficiosos y además van a aportar metabolitos no deseados. En nuestras manos está el evitar el desarrollo de microorganismos perjudiciales, que impidan el desarrollo de la fermentación maloláctica. Para lo cual, debemos controlar, desde el principio de la vinificación, factores como higiene, oxígeno, temperatura, nivel de sulfuroso, nivel de acidez etc. Así crearemos un medio apto para el desarrollo, no sólo de las bacterias malolácticas, si no que además éstas sean las "adecuadas" y además evitaremos a otras, muy perjudiciales, como las bacterias acéticas.
Asegurarse que las bacterias malolácticas, que están presentes en el vino, son las adecuadas para que realicen la fermentación maloláctica:
- Controlando los factores de desarrollo (pH, temperatura, etc.,) para que entre todas las bacterias malolácticas presentes en el vino, finalmente, se imponga Oenococcus oeni.
- Realizando la bodega su propia selección de bacterias y guardando, en microcultivos, a la bacteria maloláctica para otras campañas. Resulta muy caro este método, y aunque es una posibilidad, es muy remota.
- Utilizando cultivos liofilizados o inmovilizados, preparados por diferentes casas comerciales.
- Realizando una inoculación con vinos que ya están realizando la fermentación maloláctic, evidentemente después de haber controlado los factores para que se inpusiera Oenococcus oeni y habiendo realizado previamente un análisis de diferentes parámetros del vino, además de un concienzudo análisis organoléptico. Es como realizar "una especie de pie de cuba a la maloláctica".
Factores a tener en cuenta:
- Que las buenas prácticas higiénico-sanitarias y la adición de cultivos malolácticos seleccionados esten directamente relacionados entre si, ya que, en primer lugar, estos cultivos malolácticos seleccionados tienen menos competencia con la flora salvaje y, en segundo, porque se desarrollarán aquellas bacterias malolácticas que hemos elegido.
- Debemos inocular el vino con los niveles recomendados de un determinado cultivo comercial, para asegurarnos de que se encuentre presente un número suficiente de las bacterias "elegidas". El nivel recomendable es de 106 ufc/ml.
GRADO ALCOHÓLICO Y TEMPERATURA
- El alcohol resulta tóxico para muchas especies de levaduras y bacterias malolácticas: Al igual que ocurre con las levaduras, el alcohol altera la permeabilidad de la membrana de la bacteria resultando mortal.
Aunque la resistencia al alcohol varía según géneros, especies y cepas y los cocos son más sensibles que los bacilos, se cumple que cuanto más grado alcohólico tenga un vino, más difícil será de realizar la fermentación maloláctica.
La especie que más nos interesa que realice la fermentación es de las que más resisten al etanol, Oenococcus oeni. De hecho, el alcohol es uno de los factores que hace que, al final de la fermentación alcohólica, predomine Oenococcus oeni por encima de cualquier otra especie y, a pesar, de que no sea la que más abunda al inicio de la misma.
Por ejemplo el alcohol es un factor que se tiene en cuenta a la hora de seleccionar las bacterias malolácticas comerciales, interesandonos una cepa que pueda realizar la fermentación maloláctica en aquellos vinos con alto grado alcohólico.
- En cuanto a la temperatura, es un factor limitante: De hecho es el factor ambiental más importante para el inicio y desarrollo de la fermentación maloláctica. Las bacterias malolácticas son mesófilas.
Para llevar a cabo la fermentación maloláctica, se precisa una temperatura entre 18-22ºC. Ello obliga a la bodega a calentar el vino utilizando diversos métodos, que van desde el uso de depósitos isotermos hasta calentar el aire o, incluso, hasta la instalación de suelo radiante en bodegas de bajas producciones y vinos de calidad, sobre todo, si la fermentación maloláctica se realiza en barrica.
Las bacterias malolácticas comerciales seleccionadas son criotolerantes desarrollándose bien a temperaturas de 13-14ºC lo que evita el calentamiento de los vinos. A temperaturas bajas, se produce menor pérdida de materia colorante en los vinos tintos, y se mantienen mejor los aromas varietales; el incoveniente es que se puede formar más diacetilo.
Si la FML llega a su fin, el vino se debe enfriar, cuanto antes, para detener la actividad de las bacterias lácticas.