PRACTICAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA
Fuente: Daniel Vidal Santana 1º Enología
La microbiologia enológica es una disciplina imprescindible de conocer a la hora de la vinificación, ya que de las levaduras depende principalmente la misma, y aún siendo así, no se le presta la atención necesaria, por regla general dentro de la bodega, exceptuando las grandes bodegas, los bodegueros inoculan levaduras y bacteria comerciales, una vez inoculado no se suele llevar un control microbiológico de la fermentación, dejando que simplemente fermente sin saber que tipo de microorganismo actúa, condiciones del medio para la célula, evolución de las mismas, población bacteriana (perjudiciales y favorables), etc. Por ello las prácticas de microbiología son imprescindibles en la formación de un enólogo para poder usar todos estos conocimientos a la hora de crear un vino. Teniendo en cuenta la diversidad de procedencias que tienen los alumnos de enología es necesario empezar por lo más simple, e ir poco a poco aprendiendo como llevar el control microbiológico en bodega.
La primera práctica desarrollada consistió en la preparación de medio de cultivo, imprescindible para poder aislar microorganismos y su posterior estudio, aprendimos a realizar dos medio complejos, un medio adecuado para levadura y otro para bacterias lácticas:
- El medio destinado al aislamiento de levaduras es el llamado YPD (Yeast, Peptone, Dextrose)al que además de los compuestos necesarios para prepararlo, se añade tetraclina para evitar el desarrollo de bacterias en el mismo.
- El medio de cultivo realizado para bacterias lácticas se conoce como MRS (DeMan, Rogosa y Sharpe), este se encuentra comercializado y se rehidrata siguiendo las instrucciones del fabricante, para evitar el crecimiento de levaduras se añade actidiona.
Se prepararon para estas dos condiciones los tres tipos de soportes sólidos para el medio de cultivo, tubos de agar inclinado, tubos en picadura y placas petri de cultivo en superfìcie, estos últimos fueron los más utilizados en posteriores prácticas.
Una vez preparados los medios se procedió al aislamiento de levaduras y bacterias, pudiendo obtener aislados de microorganismos en forma de cultivos puros, y con una serie de diluciones obtener colonias aisladas a partir de mosto en las placas petri, pudiendo conocer así el numero de unidades formadoras de colonias obtenidas, calculando la concentración de células vivas. Teniendo ya aisladas las levaduras y bacterias de nuestro mosto, a partir del cual realizaremos la vinificación, procedemos al recuento de células viables y tótales, para el conocimiento decélulas viables (c.f.u./ml)se cuentan las colonias por placa y se divide por el factor de dilución y el volumen de la placa.
El recuento de células totales se determinará con la cámara Thoma o Neubauer, es un porta modificado con una hendidura de 0,1 mm de profundidad, dividida en 16 cuadrados y estos en 16 celdillas, contamos 4 cuadrados al azar y calculamos una media de células por cuadrado, si dividimos esta media por el volumen de cada celdilla tendremos la concentración de células por ml de muestra, gracias a esta medida podemos, si hemos hecho un cultivo de levaduras autóctonas de nuestra zona, inocular la cantidad necesaria para una fermentación correcta. A partir de las placas que usamos para el recuento se aislaran levaduras y bacterias en función de la morfología y así purificarlas.
Una vez hemos aislado, purificado y hecho el recuento de nuestras células, se llevan acabo la identificación de estas por distintas pruebas taxonómicas:
- Fermentación de azucares por levadura: Se basa en las observación de la producción de gas por parte de las levaduras en medios con distintos tipos de azucares y así conocer gracias a la tabla de las características principales de la especie Saccharomyces, el tipo de levadura Saccharomyces que tenemos.
- Reacción de la catalasa: esta prueba es valida tanto para levaduras como para bacterias, es una prueba sencilla basada en la capacidad de descomponer agua oxigenada gracias a la presencia de catalasa, los microorganismos que carecen de ella no son capaces de esta descomposición, consiste en la observación de la producción de burbujas al añadir una gota de agua oxigenada, si observamos burbujas la prueba será positiva y viceversa, las bacterias lácticas carecen de catalasa y serán catalasa las levaduras son catalasas +.
- Metabolismo fermentativo: Prueba utilaza en identificación de bacterias del ácido láctico, estas las podemos subdividir en tres grupos bioquímicos distinguibles por los productos formados a partir de glucosa, pudiendo ser Homofermentativa obligada, homefermentativa facultativa y homefermentativa obligada, esta prueba es muy útil, ya que no todas las bacteria lácticas son favorables a la hora de vinificar, determinadas bacterias pueden dar influencias desfavorables en la estabilidad y las cualidades organolépticas del vino.
- Observación microscópica: Preparación de las muestras y observación al microscopio estudiando su forma y tamaño.
- Tinción de Gram: Usado para bacterias, método por el cual gracias al diferente color, observado al microscopio, que tomen las bacterias tras la tinción sabremos si son gram positivas o negativas, las bacterias gram-positivas se ven de color azul/violeta, y las gram-negativas de color rojo/rosa.
Otras prácticas o análisis realizados para saber el tipo de desarrollo que tendrá nuestro proceso son:
- Estimación turbidiométrica del crecimiento celular: Gracias a la practica por turbidiometría estimaremos la curva de crecimiento de la población microbiana, basado en la dispersión de la luz que atraviesa la suspensión de nuestras levaduras, ya que la turbidez es propordonal al numero de células y se puede medir usando un espectro fotómetro.
- Conjugación de levaduras: La conjugadón de levaduras es importante para la comprensión de la multiplicadán de forma asexuada (vía vegetativa), o bien de manera sexuada, formando ascosporas; así esta práctica es una buena forma de comprensión e introducción, a mí entender, a la micromanipulación.
Como última práctica se realizo un análisis de los diferentes ensayos sobre las cepas seleccionadas en cuanto a su capacidad para realizar la fermentadón maloláctica:
- La evolución en el contenido de ácido málico y láctico se realizó, cualitativamente, por medio de Cromatografía Líquida (HPLC): Para la Cromatografía líquida, se tomo una alícuota de una muestra de 1 ml filtrada a través de membrana, y haciéndola pasar por una columna de intercambio catiónico, arrastrado por una fase móvil, los componentes de las muestras fueron detectados e identificados en base a su tiempo de retención, gracias a un detector de ácidos y un detector del índice de refracción.
- La evolución en el contenido de ácido málico y láctico se realizó, cualitativamente, por medio de Kits Enzimáticos (Boehringer Mannheim). La determinación por kits enzimáticos, se realizo basándose en la reacción de oxidación de L-malato a Oxalacetato, la cantidad de ácido málico presente se deduce midiendo la cantidad de NADH formado por la reacción de oxidación del L-Malato, la cantidad de NADH se obtendrá midiendo la absorción de luz a una longitud de onda de 340nm.
Mi conclusión sobre las prácticas a sido satisfactoria, ya que son las primeras practicas de microbiología que he realizado y creo haber obtenido los conocimientos básicos necesarios para poder realizar un estudio microbiológico, habiendo ayudado para ello la realización de las practicas conjuntas de las asignaturas microbiología y química enológica, en la cual seguimos el control de nuestra propia vinificación y la aplicación de lo aprendido en las practicas realizadas con anterioridad en esta asignatura de microbiología enológica.