TÉCNICAS DE CONTROL MICROBIOLÓGICO EN ENOLOGÍAEste artículo nos introducirá en el ámbito del análisis microbiológico. Es necesario comprender que las técnicas de laboratorio microbiológico requieren de un trabajo muy minucioso y ordenado.
1. Para ello deberemos de familiarizarnos en primer lugar, con el conocimiento y las observaciones al microscopio. Realizando observaciones en fresco y practicando las técnicas de tinción simple y diferencial.
2. Posteriormente realizaremos cultivos de microorganismos por varias técnicas, para continuar con los sistemas de control microbiológico, con manejo de autoclaves y otros métodos de control.
3. Una vez que conozcamos las técnicas básicas del laboratorio de microbiología, será el momento de aplicarlas a los microorganismos de interés enológico, aplicando aquellas técnicas que nos permitan cultivar e identificar levaduras y bacterias de interés, propias de los procesos de elaboración de vinos y productos derivados.
4. También deberemos de conocer aquellos microorganismos causantes de alteraciones y enfermedades en los vinos, pues no debemos de olvidar que el laboratorio enológico es un elemento auxiliar fundamental para el control de todo el proceso de elaboración.
5. Finalmente deberemos de saber cuales son los aspectos a controlar en una bodega, detectando en que puntos y en que momentos se deben de realizar los muestreos.
5. No olvidando que es importante aplicar los sistemas de gestión de residuos propios de los laboratorios de microbiología.
OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOSHaciendo un pequeño resumen, diremos que existen una serie de microorganismos cuya intervención y por lo tanto su control, son indispensables para llevar a cabo el proceso de elaboración del vino y de otros productos enológicos. Nos estamos refiriendo a
las
levaduras y a las
bacterias lácticas.
Pero además de los anteriores, otros microorganismos intervienen en ciertos
procesos de alteración de los vinos, tanto durante la elaboración como durante el envasado e, incluso, cuando el vino ya está embotellado.
Quizás de una forma inexplicable, las
técnicas de control microbiológico nunca ocuparon, en general, un papel importante en los laboratorios de las bodegas, a pesar de que los problemas asociados a la intervención de diferentes microorganismos han sido frecuentes.
En la actualidad la microbiología enológica está recobrando un mayor protagonismo y por todo ello, resulta de gran importancia conocer las técnicas de control microbiológico, que se pueden aplicar tanto en los procesos de elaboración como en la evaluación y prevención de alteraciones de origen microbiano.
El tamaño medio de una levadura alcanza entre 3 y 20 micrómetros (micras), mientras que el de las bacterias está entre 0,1 y 4 micrómetros (micras).Dado que el ojo humano puede llegar a distinguir objetos de
0,1 o
0,2 milímetros de tamaño, cuando se trata de una persona con muy buena visión, no es posible realizar una observación directa de los microorganismos que presentan un interés enológico.
Para poder estudiar las características o para la identificación de los microorganismos se puede recurrir a tres tipos de técnicas:
- Técnicas de microscopía.- Técnicas de cultivo.- Técnicas de experimentación biológica.Si bien estas técnicas pueden alcanzar un grado de tecnología muy amplio y sofisticado, éstas se desarrollarán en este articulo en la medida en que un técnico en vitivinicultura pueda aplicar en su ámbito laboral.
EL MICROSCOPIOEl microscopio es un instrumento imprescindible en el laboratorio de microbiología. Con el paso del tiempo, desde su descubrimiento, las mejoras han sido muchas, ocurriendo lo mismo con las técnicas de preparación de la muestra.
El microscopio proporciona la amplificación necesaria para que podamos observar organismos y estructuras que no son visibles a simple vista, existiendo un amplio abanico de tipos y escalas de aumento posibles.
Se puede decir que existen dos grandes grupos de microscopios:
Microscopios ópticos: En ellos la amplificación se produce mediante un juego de lentes ópticas. También es conocido como microscopio de luz. Existen diferentes tipos de microscopios ópticos, en función de las diferentes formas de mejorar la visualización de los objetos aumentados. Así tenemos:
- Campo Luminoso: Es el más común y de menor coste, en el que se distingue una imagen oscura sobre un fondo claro. En este tipo de microscopios se suelen usar técnicas de tinción para una mejor observación.
- Campo Oscuro: Produce una imagen brillante sobre un fondo oscuro. No es necesario teñir la muestra y permite observar microorganismos vivos.
De contraste de fases. Se basa en la diferencia entre los índices de refracción de la muestra y el medio que los rodea, logrando un mayor contraste entre los microorganismos y el medio sin utilizar tinción. Permite observar microorganismos vivos.
- Fluorescencia: Utilizan una luz ultravioleta y la muestra se tiñe con colorantes fluorescentes. La imagen se observa brillante con colores fluorescentes. Necesita prismas de cuarzo, pues el vidrio absorbe en ultravioleta y sistemas de protección que eviten los efectos de esta radiación sobre los ojos.
- Invertido: Como su nombre indica cambia las posiciones de la iluminación, por encima de la pletina y de los objetivos, que se sitúan por debajo de la pletina. Facilita el trabajo en ciertas técnicas de observación.
- Estereomicroscopio: Permite observar imágenes en 3 dimensiones.
- Digital: En realidad se trata de un microscopio óptico de los anteriores, al que se acopla una cámara digital, pudiendo reproducirse la imagen en un monitor y ser procesada mediante diversas aplicaciones informáticas.
Microscopios electrónicos: La amplificación de la imagen se basa en la utilización de un haz de electrones, que es acelerado mediante un elevado voltaje, trabajando en el vacío. La focalización se consigue con el uso de lentes magnéticas, llegando a conseguirse aumentos del orden de 10.000 a 200.000 veces. Pueden ser:
- Transmisión: Se consigue una gran amplificación trabajando con una muestra muy fina. Su coste es muy elevado y no permite la observación de microorganismos vivos.
- Barrido: Con menor poder de resolución, es necesario congelar la muestra y recubrirla con un metal. Se consigue observaciones tridimensionales.
COMPONENTES Y CARACTERÍSTICAS DE UN MICROSCOPIOExisten diferentes modelos de microscopios en los laboratorios de grandes bodegas o de centros de investigación. Pero lo más normal es que, en el entorno laboral característico de un técnico superior en vitivinicultura, nos encontremos con microscopios ópticos no muy sofisticados, pero suficientemente preparados para el trabajo que se desarrolla en el laboratorio de una bodega en cuanto a la aplicación de técnicas de control microbiológico se refiere.
Componentes y características de un microscopio:1. Oculares: Se trata de una o dos lentes situadas cerca del ojo del observador que capta y amplía la imagen formada en le objetivo. En la actualidad suelen equiparse con dos oculares (microscopios binoculares), para facilitar la observación y disminuir la fatiga de los ojos, incorporando dispositivos para ajustar la distancia entre la pupilas. Los equipos más económicos solo llevan un ocular. El ocular más común suele aportar un aumento de 10 veces el tamaño de la imagen formada en el objetivo (10X), aunque existen otros de menor o mayor aumento (5X, 7X o 15X).
2. Revólver: Dispositivo giratorio en el que se acoplan los diferentes objetivos, de manera que se pueda seleccionar cualquiera de ellos con un simple giro del revólver. El sistema de inserción de los objetivos es mediante rosca o bayoneta.
3. Objetivos: Se trata de una serie de lentes que captan la imagen de la muestra de forma invertida y aumentada. Los mas frecuentes son los de 4, 10, 40, y 100 aumentos. Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación (también se puede utilizar glicerina o monobromonaftalina). En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales que son el aumento, la apertura numérica y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos (rojo 4X, amarillo 10X, azul 40X y blanco 100X). También puede figurar la inscripción PLAN en referencia a que se trata de objetivos planos. Los objetivos apocromáticos llevan una corrección de defectos cromáticos (aberraciones cromáticas).
4. Tornillo macrométrico: Mando que permite el desplazamiento rápido de la platina en forma ascendente y descendente, para acercar o alejar el objetivo de la muestra. Se utiliza para aproximar y localizar la imagen deseada.
5. Tornillo micrométrico: Con la misma función que el anterior, pero su accionamiento provoca desplazamientos más lentos de la platina. Se utiliza para ajustar el enfoque tras aproximarlo con el tornillo macrométrico. En algunos modelos llevan un dispositivo que puede fijar la platina a una altura determinada.
6. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, que permite el paso de luz procedente de la fuente luminosa situada por debajo. La muestra se pone sobre el orifico en un portaobjetos de vidrio o plástico (al que se denomina usualmente
porta) y es retenido mediante dos pinzas.
7. Fuente luminosa: Suele tratarse de una lámpara halógena de intensidad graduable mediante un reóstato, situada en el pie del microscopio. Se enciende y se apaga con un interruptor y en algunos modelos lleva un soporte para colocar filtros que facilitan la visualización. En equipos más económicos, la fuente luminosa es la luz solar que se hace incidir sobre la muestra mediante un sistema de espejos.
8. Condensador y diafragma: El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina cuya función es la de concentrar la luz generada por la fuente luminosa y focalizarla hacia la preparación. Se complementa con el diafragma cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la cantidad de luz y ajusta la Apertura Numérica).
9. Tornillos de desplazamiento de la platina: La platina se puede desplazar horizontalmente mediante un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento. El sistema permite mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a derecha y viceversa. También suele llevar un nonius que permite fijar las coordenadas de cualquier campo óptico y localizar así un detalle de la preparación y volver a observarlo cuando interese.
10. Brazo: Columna vertical o arqueada que soporta los oculares y objetivos.
11. Pié: Sirve como base del microscopio y tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato. En él se integra la fuente luminosa.
CARACTARÍSTICAS DE UN MICROSCOPIOLos
microscopios ópticos se utilizan para estudiar
microorganismos o
estructuras muy delgadas, ya que disponen de una profundidad de campo muy limitada. Es necesario que la luz atraviese la muestra desde abajo y a menudo necesitan técnicas especiales para aumentar el
contraste de la imagen.
- Poder de resolución:Entendemos por poder de resolución de un microscopio a la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados.
El poder de resolución de un microscopio está en función de la
longitud de onda de la luz empleada y de la
apertura numérica que es una característica del sistema de lentes.
- Apertura numérica: La apertura numérica (AN) viene dada por la expresión:
- Φ: Es la mitad del ángulo de apertura (determinado por el eje óptico y los rayos más externos que capta el objetivo)
- n: Es el índice de refracción del medio que llena el espacio entre el objetivo y el cubreobjetos.
- Índice de refracción: En los objetivos secos n = 1 que es el
índice de refracción del aire, pero cuando se emplea aceite de inmersión, n = 1.56, en cuyo caso la AN es mayor.
La máxima AN de un objetivo seco normal es inferior a 1 y la de un objetivo de inmersión oscila entre 1.2 y 1.4.
-
El límite de resolución: Es decir, el objeto más pequeño que se puede distinguir, se consigue con la longitud de onda más corta de la luz visible y un objetivo que tenga el máximo de AN.
El límite de resolución o máximo poder de resolución se determina de la siguiente manera:
- Supongamos una onda luminosa a la que se interpone un filtro verde λ = 0.55 µm.
- Un objetivo de inmersión de AN = 1.20.
- Un condensador con una AN = 0.9.
Esto significa que:
El objeto más pequeño que podemos distinguir con un microscopio típico de luz es aproximadamente de 0.2 µm.Los aumentos superiores al poder de resolución no son útiles, pues se pierde definición al aumentar el tamaño resultando una imagen borrosa y poco definida.
MANEJO DEL MICROSCOPIOEs muy habitual que las primeras experiencias de observación de microorganismos resulten tediosas, siendo complicado conseguir una buena observación. Es preciso practicar la técnica de enfoque, para lo que se recomienda seguir el procedimiento siguiente:
1. Coloca el
portaobjetos con la muestra en
la platina, de manera que cubra el hueco central y sujétalo con la pinza. Fíjate en que tiene una posición adaptada a la forma del portaobjetos.
2. Acciona el interruptor de encendido de la luz y con el
reóstato ajusta la intensidad de la misma.
3. Coloca la muestra centrada sobre el haz luminoso, accionando los tornillos de ajuste de la platina.
4. Gira el
revólver y selecciona el objetivo de menor aumento (4X).
5. Haciendo uso del
tornillo macrométrico, sube la platina hasta su posición más alta (suele llevar tope). Esta operación se hace observando sin poner los ojos en el objetivo.
6. Pon los ojos sobre los objetivos y ajusta la distancia interpupilar. Debes de observar una única imagen.
7. Haciendo uso del
tornillo macrométrico vete bajando lentamente la platina, hasta que observes alguna imagen. Si llegas al final del recorrido y no encuentras ninguna imagen, inicia de nuevo el proceso o se accionan los tornillos de la platina buscando alguna imagen. Si la muestra está teñida, observarás una
mancha coloreada.8. Una vez localizada alguna imagen o mancha, consigue el enfoque con el
tornillo micrométrico.9. Gira el revólver seleccionando el objetivo siguiente (10X). Normalmente los microscopios están calibrados y al cambiar el objetivo el enfoque varía muy poco, por lo que sólo es necesario ajustarlo con el tornillo micrométrico.
10. Procede de igual manera con el objetivo de 40X.
11. Si necesitas un aumento mayor, debes de seleccionar el objetivo de 100X. Pero recuerda que se trata de un
objetivo de inmersión, por lo que deberás de colocar una gota de
aceite de cedro, u otro aceite líquido apropiado, sobre el portamuestras. Si giras el revólver a una posición intermedia entre objetivos, te resultará más fácil poner la gota de aceite.
12. Gira hasta colocar el objetivo sobre el haz, de manera que toque la gota de aceite.
13. Procede al enfoque con el
tornillo micrométrico lentamente, pues es fácil pasarse en el enfoque. Procura que el objetivo no llegue a tocar el
portaobjetos.14. Puedes mover con mucho cuidado los
tornillos de desplazamiento de la platina para observar otras zonas de la muestra preparada.
15. Una vez finalizada la observación, baja la platina a su posición inferior y retira el portaobjetos, liberando
la pinza.16. Procede a limpiar el objetivo de inmersión, utilizando un trozo de
papel especial para limpieza impregnado de
xilol puro.
17. Limpia también, las posibles manchas de la platina.
18. Si no vas a utilizar de nuevo el microscopio, baja la intensidad de la luz con el reóstato y apaga el interruptor. Protege el microscopio con la funda y guárdalo en un lugar seco y seguro.
OBSERVACIÓN Y RECUENTO DE MICROORGANISMOSExisten diversos tipos de microscopios, aunque en los laboratorios de las bodegas en los que se haga control microbiológico, lo más frecuente es que se disponga de un microscopio óptico de campo claro, por lo que la preparación de muestras se hará para este tipo de aparato.
Para observar microorganismos de interés enológico, se puede recurrir a dos tipos de preparación:
- Preparaciones en Fresco: Se utilizan cuando se pretende observar los microorganismos vivos, pudiendo buscar determinadas finalidades como:
- Estudiar la movilidad (aunque la mayoría de microorganismos de interés enológico son inmóviles, algunas bacterias presentan movilidad, como las bacterias acéticas).
- Evitar alteraciones de los microorganismos sensibles a otras técnicas de preparación, lo que dificultaría su identificación o estudio.
- También es empleada en casos de
cambios citológicos (división celular) o en la observación de
inclusiones, ya que al ser secadas cambia
la refringencia.Para su preparación es necesaria la suspensión de los microorganismos en un líquido y existen tres técnicas de observación:
- Montaje Húmedo: Se vierte una gota de la suspensión sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos.
- Gota Pendiente: El portaobjetos empleado tiene una concavidad. La gota se aplica sobre el cubreobjetos y se deja colgando en la concavidad.
- Coloración Vital: Con la finalidad de poner de relieve
detalles estructurales, se añade un colorante en dosis bajas para no matar el microorganismo. Se emplean colorantes como azul de metileno, rojo congo, etc.
- También es interesante para determinar el
número de células vivas y muertas en un cultivo, como puede ocurrir en el control del proceso de fermentación.
- Preparaciones Teñidas: Son empleadas para la observación de
características morfológicas de los microorganismos, pudiendo utilizarse tinciones selectivas o diferenciales.
Los colorantes empleados pueden ser ácidos, básicos o neutros.
- Ácido o Aniónico: Aquel cuyo ión es negativo y se combina con proteínas. Ejemplos: Eosina, fucsina o rojo congo.
- Básico o Catiónico: Son iones positivos que se unen a componentes negativos de la célula, como ácidos nucleicos, compuestos polisacáridos ácidos. Ejemplos: azul de metileno, violeta cristal o safranina.
El proceso de tinción supone una reacción de intercambio iónico entre el colorante y los puntos activos de la superficie o del interior de la célula. La tinción puede ser:
- Tinción Simple: Por inundación con un solo colorante.
- Tinción Diferencial: Consistente en someter la preparación a una serie de reactivos de una forma secuencial, permite distinguir células de distinto tipo o partes diferentes de la célula. La más importante de estas tinciones es la tinción de Gram.
PREPARACIONES EN FRESCOExiste la posibilidad de observar la diversidad de microorganismos presentes en el mosto antes, durante y después de la fermentación. También podemos pensar en otros productos como un vinagre o un licor de tiraje para elaborar vinos espumosos o una rejilla de desagüe de la bodega. También existen muchos más.
Independiente del tipo de muestra y la técnica de extracción y obtención de la suspensión con los microorganismos a observar, los métodos de preparación son muy semejantes.
Observación de Microorganismos Mediante Montaje Húmedo:- Toma un portaobjetos bien limpio y seco. Sujetándolo por los bordes, colócalo de forma horizontal sobre el soporte de una cubeta de vidrio.
- Pon una gota de
suspensión con los microorganismos a observar sobre el portaobjetos y protégelo con una
laminilla cubreobjetos (también llamado cubre). Si vas a tardar en realizar la observación, puedes sellar los lados con vaselina para evitar que se seque la preparación.
- A continuación procede a su observación al microscopio siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
Observación de Microorganismos Mediante Montaje de Gota Pendiente:- Toma un
portaobjetos excavado bien limpio y seco. Sujetándolo por los bordes, colócalo de forma horizontal sobre el soporte de una cubeta de vidrio. Ayudado con un palillo, pon un poco de
vaselina en el borde de la concavidad.
- Pon una gota de la suspensión microbiana a observar, en el centro de un cubreobjetos y con mucho cuidado colócalo sobre la
concavidad de manera que la gota quede suspendida en el centro de la misma. Presiona un poco sobre el cubreobjetos para evitar la evaporación al sellar con la vaselina.
- El proceso también se puede hacer colocando el porta excavado sobre el cubre, volteando posteriormente el conjunto para dejar la gota suspendida.
- Coloca el porta con delicadeza sobre la platina del microscopio e inicia la observación con el
objetivo más pequeño y el
diafragma cerrado unas
dos terceras partes, hasta conseguir enfocar la gota. Continúa con el procedimiento general de observación, buscando la observación en los
bordes de la gota.
Esta preparación nos permitirá observar la posible movilidad así como la fisión binaria y otros aspectos.
RECUENTO DE MICROORGANISMOSExisten numerosas técnicas instrumentales para hacer un recuento de microorganismos en una suspensión. El problema es que su coste es elevado para las aplicaciones del laboratorio de una bodega, por lo que se recurre a técnicas más simples como el recuento mediante observación con el microscopio.
Se trata de una técnica rápida y económica y no exige un equipamiento sofisticado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, siendo las más utilizadas las cámaras de
Neubauer, la de
Thoma, la de
Hawksley o la de
Petroff-Hausser. Aunque la mayoría de los recuentos se realizan observando con objetivos secos, la cámara de
Hawksley puede ser utilizada con
objetivos de inmersión.
Aún así, esta técnica requiere de cierta pericia y experiencia, pues existe una cierta dificultad para obtener reproducibilidad en el llenado de la cámara con líquido.
Además las células microbianas tienden a adsorberse en las superficies del vidrio, tanto de recipientes como de pipetas, lo cual dificulta la obtención de
diluciones exactas, si bien se puede minimizar este efecto al realizar las diluciones en una
solución fisiológica.Las cámaras de recuento permiten trabajar con el microscopio de
campo claro o con el de
contraste de fases.La de
Neubauer, por ejemplo, se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas, en las cuales se ha marcado una cuadrícula de dimensiones conocidas.
Para su uso se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple
tensión superficial.A continuación mediante una
micropipeta o un
capilar se introduce la suspensión a contar, generalmente diluida, por capilaridad entre la cámara y el cubrecámara, Puesto que tiene dos zonas, permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para contar las células se observa el
retículo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las células.
Según el número de células microbianas contadas y conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la
concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial.
La fórmula de cálculo del número de células (válida universalmente) es la siguiente:
A modo de ejemplo y observando las imágenes adjuntas, en las que se muestra una cámara cuya profundidad es de
0.1mm y en la que cada cuadrado mediano del retículo es de
0.2 x 0.2 mm, puedes realizar un recuento simulado de levaduras con los siguientes datos:
- Nº de cuadrados medianos en los que cuentas células: 5.
- Superficie del cuadrado: 0.04 mm2 cada cuadrado = (0.2 mm)2.
- Nº total de células que has contado: 630.
- Dilución de la suspensión: 1:200
- Objetivo de 40X.
OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS CON TINCIÓNEn el control microbiológico puedes recurrir a técnicas de tinción simple o diferencial. En enología la tinción diferencial es menos utilizada, siendo de mayor utilidad cuando se trabaja en el control bacteriano de productos alimentarios. Aún así te resultará útil para el control del agua en la bodega y otras aplicaciones.
La preparación de observaciones con tinción requiere los pasos siguientes:
- Extensión.- Fijación.- Tinción.- Lavado y secado.Tinción Simple:- Cuando la muestra se trata de un
líquido, como puede ser un mosto o un vino con la dilución correspondiente, pon una pequeña gota del mismo sobre el porta. Para ello ayúdate de un
asa de siembra estéril.- Si la muestra es
sólida, como puede ser un cultivo o el retenido de una filtración, pon una gota pequeña de agua sobre el porta. Con el asa de siembra estéril toca en la muestra y
frota sobre la gota de agua. Es importante que la cantidad de muestra arrastrada por el asa de siembra sea pequeña, para poder observar los microorganismos separados (dilución).
-
Extiéndela por el vidrio formando una
capa fina.
-
Seca la preparación al aire.
- Procede a la
fijación. Para ello sujeta en porta con una pinza de manera que la extensión quede hacia arriba y pásala rápidamente, 3 o 4 veces, por encima de la llama de un mechero bunsen o de alcohol. No debe de quedar nada de líquido.
- A continuación deja caer una o dos gotas del
colorante seleccionado sobre la fijación, de manera que la inunde en su totalidad. Mantenla así de
1 a 3 minutos.- Lava el exceso de colorante con agua destilada abundante con un frasco lavador común.
- Seca la preparación y obsérvala al microscopio, siguiendo el procedimiento conocido.
- Recuerda la gran diferencia de tamaño entre las levaduras y las bacterias, pues mientras que para las primeras suele ser suficiente observarlas con el objetivo de
40X y el ocular de
10X (400 aumentos), para las bacterias es necesario recurrir al objetivo de inmersión
100X para lograr los 1.000 aumentos.
Tinción de Esporas:- Prepara un frotis de la cepa a estudiar en una gota de agua sobre un porta y fíjala por calor.
- Añade verde malaquita de manera que cubra abundantemente la preparación y pasa el porta por encima de la llama del mechero de forma suave, provocando una emisión de vapores que debe durar unos 3 minutos.
- Lava con agua.
- Cubre la preparación con safranina y déjalo durante 1 minuto.
- Lava con agua.
- Observa al microscopio con objetivo de 40X o con el objetivo de inmersión 100X.
- Anota si hay presencia de esporas, su número y forma.
TINCIÓN DE GRAMSe llama tinción de Gram porque un científico danés llamado Hans Christian Gram fue quién puso a punto esta técnica.
Se trata de una tinción diferencial cuyo objetivo es contribuir a la identificación y clasificación de las bacterias.
Para su realización, procede como se expone a continuación:
- Realiza la
extensión y
fijación como si se tratara de una tinción simple.
- Inunda con violeta cristal y deja
un minuto para que se tiña.
- Lava con agua destilada hasta que no salga más colorante.
- Inunda con la
solución de lugol, dejándolo en contacto durante
un minuto.- Lava el exceso de lugol con agua.
- Decolora con
alcohol-acetona durante
30 a 60 segundos.- Inundar con el colorante de contraste, la
safranina o la
fucsina, durante
1 minuto.- Lava con agua abundante y
seca al aire.
- Examina al microscopio, teniendo en cuenta que debe de observar la preparación con el objetivo de inmersión.
Las bacterias que retienen el colorante inicial (violeta) son
Gram (+) y las que se decoloran con alcohol y toman el colorante de contraste (rosa o rojo) son
Gram (-).
Las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta, mientras que las bacterias Gram negativas se tiñen de rosa.La teoría sobre el mecanismo de la tinción Gram, se basa en la
diferencia de composición de la pared celular de las bacterias. Así mientras que unas poseen una pared rica en
pétidoglucano (Gram +), en otras la pared celular presenta una membrana externa rica en
lípidos (Gram -).
En el caso de las bacterias
Gram positivas, por su bajo contenido de lípidos, éstas presentan una
baja permeabilidad con el disolvente orgánico, por lo que puede retener el colorante primario con el que se ha teñido la muestra y se observarán de un
color violeta. En el caso de las bacterias
Gram negativas, por su alto contenido en lípidos, al aplicar alcohol se produce una
permeabilidad suficiente como para que salga el
complejo lugol-cristal violeta y no poder retener el colorante primario. Por ello se decoloran y son nuevamente coloreadas con el colorante de contraste utilizado, observándose las bacterias de un
color rosa o rojo.
OBSERVACIÓN DE MOHOSEl interés puede tener la observación de mohos en el laboratorio de una bodega, es debido a que un técnico en vitivinicultura puede desarrollar su trabajo tanto en una bodega como en una explotación vitícola y en un viñedo los mohos tienen una gran importancia.
Los
mohos son un tipo de hongos pertenecientes a diversas especies que crecen en forma de
filamentos, conocida como
micelio, generalmente pluricelulares, cuyo desarrollo es favorecido por condiciones
cálidas y
húmedas. Se reproducen y propagan mediante
esporas, siendo la morfología de éstas y la forma de agrupación, algunos de los parámetros que se utilizan para su identificación.
En el mundo de la vitivinicultura, a menudo nos encontramos con la presencia de diferentes hongos, como
causantes de alteraciones en las uvas o simplemente como
enfermedades de la viña durante el ciclo productivo.
El estudio profundo de este tipo de microorganismos es complejo y a menudo se escapa del ámbito laboral del técnico en vitivinicultura. Aún así, la disponibilidad de un laboratorio microbiológico, puede permitir la observación de sus estructuras e identificar o descartar el agente causante de una enfermedad o alteración de las uvas, durante sus etapas de cultivo.
Para la
observación directa de estos hongos, podemos utilizar una
lupa binocular o el
microscopio, utilizando objetivos de pocos aumentos. También podemos cultivarlos en placas con medio sólido, realizando la observación directamente sobre la placa.
Para observar si las
hifas son tabicadas, las
estructuras y
organización de las esporas u otras partes del hongo, podemos transferir una porción del cultivo a un porta, en el que habrás puesto una gota de
azul de lactofenol. Nos podemos ayudar de una aguja o un asa de siembra estéril. Pon un crubeobjetos sobre la preparación.
En este tipo de preparación suele romperse o desorganizarse las estructuras, por lo que resulta más difícil la identificación.
Para evitar este inconveniente podemos recurrir a un cultivo en portaobjetos o
microcultivo, ya que permite realizar la observación sin alterar el desarrollo del mismo, procediendo del siguiente modo:
- Toma un cubreobjetos y pon en 3 de los 4 lados, un cordón de
cera o
parafina estéril. Colócale encima un portaobjetos
caliente de manera que entre el porta y el cubreobjetos quede un espacio de
1 ó 2 milímetros. Al estar caliente se fijarán mejor el cubre y el portaobjetos.
- Funde un medio de cultivo específico con agar (
Sabouraud) y déjalo enfriar a 50 ºC. Inocúlalo con esporas del hongo a estudiar y después de mezclar, rellena el espacio con una pipeta pasteur o un micropipeta estéril, hasta que se llenen
dos tercios del mismo.
- Introduce este portaobjetos en una
caja petri estéril, que tenga papel de filtro húmedo en el fondo.
- Después de incubar entre
24 y
72 horas, podrás observar el hongo sin deteriorar sus estructuras características.
CULTIVO, NUTRICIÓN Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOSNo es posible distinguir los microorganismo a simple vista. Por ello se recurre a las observaciones microscópicas y también al cultivo de microorganismos.
El cultivo de microorganismos nos permite obtener colonias visibles, de las que estudiamos diversos parámetros como morfología, comportamiento ante diferentes factores, etc. Además también podemos realizar preparaciones para observar al microscopio y comparar con las obtenidas por muestreo en la bodega u otras instalaciones.
Cultivar un microorganismo significa proporcionarle los nutrientes y las condiciones ambientales idóneas para su desarrollo, evitando la influencia de factores externos. Se conoce como
cultivo microbiano al conjunto formado por las células, los compuestos químicos del medio y las nuevas sustancias generadas por el metabolismo microbiano.
Un
cultivo puro o
axénico es aquel que solo tiene un tipo de microorganismo, mientras que si coexisten más de un tipo se denomina
cultivo mixto.El objetivo del cultivo de microorganismos es conseguir la máxima población en el menor tiempo posible, para lo cual se deben de cumplir las siguientes condiciones:
1. Conseguir un
medio que satisfaga las necesidades nutricionales que necesita el o los microorganismos cultivados, para alcanzar un desarrollo rápido y una alta tasa de multiplicación. En la actualidad existen medios que se adaptan al cultivo de la mayoría de los microorganismos de interés enológico.
2. Procurar la ausencia en el medio de todo
microorganismo distinto al que se desea cultivar. Para ello deberás de tener muy en cuenta, los consejos de seguridad y normas de trabajo en los laboratorios microbiológicos.
3. Conseguir las
condiciones físicas y ambientales idóneaspara el crecimiento y multiplicación de los microorganismos cultivados. Para ello debemos de ajustar los siguientes factores:
Temperatura: Según las exigencias de temperatura los microorganismos se clasifican en:
- Psicrófilos: Capaces de desarrollarse a 0º C, aunque crecen mejor a temperaturas cercanas a los 15 o 20ºC.
- Mesófilos: Aquellos que se desarrollan mejor entre los 25 y 40 ºC.
- Termófilos: Aquellos que se desarrollan bien por encima de los 45 ºC.
Necesidades de Gases: Según las necesidades de oxígeno, se clasifican en:
- Aerobios: Se desarrollan en presencia de oxígeno a la concentración del aire.
- Anaerobios: Se desarrollan en ausencia de oxígeno libre. Para ellos el oxígeno es tóxico.
- Anaerobios facultativos: Se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.
- Microaerófilos: Crecen en presencia de oxígeno, pero a concentraciones inferiores al aire.
pH: Cada tipo de microorganismo tiene un intervalo de valores idóneo para su crecimiento, por lo que el medio de cultivo debe de ajustarse a ese valor de pH. Según el pH óptimo pueden ser
acidófilos o
basófilos.
MEDIOS DE CULTIVOUn medio adecuado, para el cultivo de los microorganismos que aparecen en un mosto, podría ser el propio mosto estéril, pero no del todo, pues si bien es cierto que pueden vivir en ese medio, cultivar un microorganismo es buscar un crecimiento rápido y una tasa de multiplicación muy elevada. Por ello, a continuación se describen los diferentes tipos de medios que se pueden utilizar para lograr este objetivo.
Un medio de cultivo debe de proporcionar los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos que se pretenden cultivar, en la forma química adecuada (biodisponibilidad) y en la proporción adecuada. Si bien es posible elaborar medios de cultivo partiendo de productos naturales o comunes (huevo, leche, sangre, extractos de carne, etc.), lo más práctico es recurrir a medios sintéticos, en los que se parte de productos de gran pureza que se mezclan en las proporciones necesarias y se estabilizan con diversos componentes. El principal inconveniente de su uso, es que resultan más caros.
Tipos de Medios de Cultivo:Según su estado físico pueden ser:
- Sólidos (agar).
- Semisólidos (consistencia de natillas con un 0.5 % de agar).
- Líquidos (caldos).
La diferencia entre ambos reside en que los sólidos llevan un agente solidificante que suele ser agar.
Según su composición pueden ser:
- Generales: En ellos crecen multitud de microorganismos ya que aportan los nutrientes más esenciales. Son ejemplos de éstos, el agar nutritivo, el caldo nutritivo, el medio PCA, etc.
- Enriquecidos: Son medios genéricos a los que se añade sangre, suero o extractos de tejidos animales o vegetales, de manera que se incrementa el valor nutritivo del medio y puede soportar el crecimiento de microorganismos heterótrofos exigentes.
- Selectivos: Impiden el desarrollo de un grupo de microorganismos facilitando el crecimiento de otros, al eliminar competidores por los nutrientes. Un ejemplo es el medio Mc Conkey, que añade cristal violeta que va a impedir el crecimiento de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de Gram negativas. El medio Sabouraud con antibióticos para el cultivo de hongos y levaduras, impide el crecimiento de bacterias.
- Diferenciales: Contienen componentes que hacen posible diferenciar unos microorganismos de otros. Por ejemplo el agar sangre permite diferenciar a los microorganismos hemolíticos de los no hemolíticos.
- Caracterización: Llevan componentes utilizados por el metabolismo microbiano y cambian de color u otra característica cuando son empleados. Se emplean para la caracterización de bacterias y otros microorganismos. Por ejemplo el medio TSI, el medio indol o el medio citrato.
- Ensayo: Para ensayar vitaminas, aminoácidos, antibióticos o bien para probar desinfectantes.
- Mantenimiento o Conservación: Para preservar las características fisiológicas y la viabilidad de los microorganismos durante largo tiempo. Un ejemplo es el medio utilizado para conservar levaduras por congelación.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOEn la actualidad preparar un medio de cultivo, se trata de un procedimiento muy sencillo.
En los laboratorios enológicos se suele trabajar con medios de cultivo sintéticos, que normalmente se presentan en forma de polvo, al ser sometidos a un proceso de deshidratación o liofilización. De estos medios, los más comunes son el medio Sabouraud, el YPD+tetraclina y el YM para cultivo de levaduras, el medio MRS+ ictidiona (DcMan, Rogosa y Sharpe) o el medio Elliker para bacterias lácticas y estreptococos, o los medios de Gorodkowa o Wickrham para esporas.
También se utilizan como medio, el mosto y el vino estériles y otros productos naturales.
Procedimiento de Preparación de un Medio: 1. Lee con atención las etiquetas de los productos que vas a utilizar, siguiendo los consejos y pautas de seguridad recomendadas. La mayoría de los productos para microbiología se distribuyen con las etiquetas en lengua inglesa, por lo que es importante que te familiarices con la terminología específica, para no cometer errores en la interpretación de las instrucciones de uso y manejo.
2. Recuerda que debes de trabajar en condiciones de esterilidad para evitar contaminar el producto. Para ello debes de utilizar
espátulas estériles y tener el frasco abierto el menor tiempo posible. Si no dispones de cámara de flujo laminar, enciende un mechero bunsen o de alcohol en el entorno de trabajo.
3. Pesa, con balanza granataria, la cantidad de medio liofilizado necesaria para preparar el volumen que vayas a utilizar. En la etiqueta se especifica la dosis recomendada. Puedes utilizar como un vaso de precipitado estéril o un trozo de papel de aluminio.
4. En un vaso de precipitado o en un frasco de vidrio de boca ancha y vidrio pirex, añade un poco de agua destilada estéril y remueve hasta formar una
pasta homogénea con el medio.
5. Añade agua destilada estéril y caliente sobre la pasta, removiendo hasta formar una suspensión totalmente homogénea. Puedes utilizar un
agitador magnético para facilitar el proceso.
6. Si es necesario,
ajusta el pH al valor óptimo de desarrollo de los microorganismos a cultivar.
7. Pasa la suspensión a un
frasco de vidrio pirex con tapón roscado para medios de cultivo, tápalo sin enroscar totalmente y esterilízalo en autoclave.
En la preparación de medios de fácil disolución, puedes pesar directamente en el frasco y preparar la suspensión en el agitador magnético con calefacción. Si no conoces las características del medio es preferible que prepares la pasta, pues ahorrarás tiempo en la preparación.
Una vez esterilizado, enrosca totalmente el frasco y dispénsalo en placas, en tubos o bien almacénalo para usos posteriores.
En caso de ser un medio sólido, se solidificará al enfriar, por lo que debes de proceder con rapidez.
PREPARACIÓN DE TUBOS Y PLACASExisten diferentes tipos de recipiente para cultivo de microorganismos. En principio, cualquier envase que pueda ser esterilizado y no alterar los medios ni las condiciones de cultivo, puede ser utilizado para tal fin, aunque lo más usual es recurrir al material diseñado para esta finalidad, ya que ahorrarás tiempo y a la larga te resultará más económico.
- Cultivo en Tubos de Vidrio: Puedes utilizar tubos de vidrio de 20 x 200 mm o de 16x160 mm,
resistentes al calor, aunque los diferentes fabricantes pueden ofrecer otras medidas, en función de equipamientos o preferencias de los laboratorios.
Como tapa de los tubos se usó durante mucho tiempo el
algodón graso, si bien en la actualidad existen tapones de
plástico o
aluminio a un precio asequible. También puedes encontrar tubos con
tapa roscada. En todo caso, el tapón utilizado debe de resistir las condiciones de esterilización, normalmente por acción del calor, como veremos posteriormente.
Si se trata de medios líquidos, los tubos se llenan con los medios
hasta la mitad de su capacidad o un poco más y se tapan, esterilizándolos en autoclave. Cuando se trata de un medio sólido, llena los tubos cuando la temperatura del medio esté alrededor de 50 ºC. Deja que
enfríe y se
solidifique en una gradilla. Otra opción es que
enfríe inclinado, apoyándolo sobre una varilla de vidrio, con la finalidad de conseguir que solidifique en
forma de bisel (punta de flauta o
slant) para lograr una mayor superficie de cultivo.
- Cultivo en Placas de Petri: Para el cultivo de microorganismos en medio sólido, las placas de petri, presentan la ventaja de ofrecer una
gran superficie útil, permitiendo aplicar diversas
técnicas de cultivo y
aislamiento. Pueden ser de
vidrio o de
plástico desechable, siendo éstas últimas las más utilizadas al comercializarse esterilizadas a un bajo coste.
Para su llenado, se aconseja trabajar en una
campana de flujo laminar o bien generar un espacio protegido bajo la llama de un mechero bunsen o de alcohol. En ambos casos, es recomendable
desinfectar la superficie de trabajo con una servilleta de papel o algodón empapado en alcohol.
Las placas se llenan hasta
dos tercios de su capacidad con el medio a
40-50 ºC, utilizando
guantes térmicos si fuese necesario. Al tapar las placas se condensa agua en las tapas. Para eliminarla, espera a que se solidifique el medio, destapa y coloca la placa boca abajo, apoyando sobre ella la tapa. Espera a que se evapore el agua condensada, manteniendo la campana de flujo laminar en funcionamiento o el mechero encendido. Una vez seca, tapa de nuevo y
precinta los bordes si no vas a utilizarla a continuación.
También podrás adquirir placas estériles preparadas con diferentes tipos de medio, listas para usar. El inconveniente que presentan es que su
coste es más elevado y deben de ser utilizadas en un periodo corto de tiempo.
Además de estos formatos estándar, se comercializan otros productos listos para usar, en formatos diversos y que en algunos casos sirven para inocular in situ.
MÉTODOS DE SIEMBRA DE MICROORGANISMOSPara cultivar los medios de cultivo, el proceso se inicia con la siembra o inoculación de los mismos en los medios preparados.
Para evitar la contaminación de los medios con microorganismos ajenos al cultivo, debes de trabajar en un ambiente estéril, dentro en una cabina de flujo laminar o bajo la llama de un mechero. Además, es recomendable pasar una servilleta de papel o un algodón empapado en alcohol, sobre la superficie en la que se va a trabajar, con el mechero apagado o lejos de él.
Antes y después de tocar materiales con microorganismos, esteriliza el asa de siembra en la llama del mechero, de manera que la punta alcance el rojo vivo.
- Siembra en Medio Líquido: Rellena tubos de ensayo, matraces erlenmeyer o frascos de boca ancha con medio de cultivo líquido y esteriliza en autoclave. Posteriormente inocula mediante un asa de siembra en ambiente estéril.
- Aislamiento por Estría en Placa con Medio Sólido: Mediante un asa de siembra, extiende con suavidad una pequeña cantidad de muestra sobre la superficie del medio solidificado, haciendo estrías en zigzag. Conforme las vas haciendo, cada vez vas depositando menos microorganismos en la superficie del medio. A continuación esteriliza el asa y una vez fría, toca en la región donde has realizado las últimas estrías y continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. De esta manera vas obteniendo diluciones progresivas, hasta que la separación te permita un fácil aislamiento.
- Siembra en Tubos en Slant: Realiza una sola estría sobre la superficie del tubo con medio sólido con superficie inclinada, empezando por la parte inferior y arrastrando el asa de siembra hasta la parte superior.
- Siembra en Tubos por Picadura: Con el asa de siembra recta e inoculada en la muestra, pincha el medio sólido hasta el fondo del mismo, procurando hacerlo en el centro del tubo. Se suele combinar la siembra por picadura con la estría en
slant.
- Siembra de Placas por Vertido: Partiendo de la suspensión con microorganismos, prepara una serie de diluciones decimales sucesivas y mézclalas con el medio antes de solidificar (40-50 ºC). Viértelas en placas estériles. Una vez solidificadas somételas a incubación. Esta técnica permite el desarrollo de las colonias en el interior del medio y no sólo en la superficie, siendo especialmente útil cuando se trata de microorganismos anaerobios.
- Siembra por Agotamiento: Otra opción es que, partiendo de la serie de diluciones, realices la siembra sobre placas con medio solidificado. Para ello pasa 1 mililitro de cada una de las diluciones decimales a una placa y extiéndela por la superficie hasta que no observes nada de líquido. Puedes utilizar un asa de siembra normal o mejor un asa de drigalsky.
- Como sistema para economizar medios de cultivo y placas, puedes recurrir a la técnica de
siembra de gotas, dividiendo la placa en tantas bandas como diluciones. En cada banda pones 3 ó 4 gotas con una pipeta pasteur o puntas de pipetas plásticas.
INCUBACIÓNEn microbiología incubar significa exponer un cultivo de microorganismos, sembrados o inoculados en un medio, a las
condiciones ambientales idóneas para su crecimiento durante un tiempo determinado.
Pero cuando se habla de condiciones ambientales, para que un microorganismo se desarrolle es necesario que disponga de los
nutrientes necesarios y de aquellos factores físicos que posibilitan un buen desarrollo, en el menor tiempo posible.
Los nutrientes necesarios para cultivar cada tipo de microorganismo, son aportados por los diferentes medios de cultivo. De igual forma, el pH óptimo se ajusta al elaborar el medio.
Los factores físicos a tener en cuenta en el laboratorio, son la
temperatura y los
requerimientos gaseosos. Se conoce como temperatura de crecimiento óptimo (TCO), a la temperatura que permite el mayor crecimiento de una determinada población de microorganismos en el menor tiempo posible. Para fijar una
temperatura de incubación, es necesario conocer cuál es la temperatura óptima de crecimiento (TCO) del microorganismo que pretendemos cultivar. Cuanto más se acerque la temperatura a su TCO, mayor será la tasa de crecimiento.
Cuando se trata de incubar un cultivo mixto de microorganismos, se debe de ajustar una temperatura que favorezca al mayor número de microorganismos presentes.
Así, aquellos microorganismos que afectan a los seres humanos, se
cultivan a 37 ºC que es la temperatura corporal. De igual forma para estudiar los
microorganismos de interés enológico, se ajustará la temperatura normal de los procesos espontáneos de fermentación, es decir entre
25 y 28 ºC, aunque en ocasiones podemos cultivar a otras temperaturas para estudiar el comportamiento de una determinada levadura o bacteria.
Para incubar levaduras, hongos y bacterias de interés enológico, se utilizan las
estufas de incubación, existiendo numerosos modelos en cuanto a formas, tamaño y sistemas de regulación.
En general, constan de una estufa tipo
poupinel con interior de acero inoxidable, equipado con
doble puerta. La puerta interior es de vidrio resistente a la temperatura de trabajo, mientras que la exterior es metálica con una capa aislante. El objeto de la doble puerta es evitar la
fluctuación de la temperatura cuando se abre para manipulación de los cultivos.
En las estufas se incuban cultivos en
tubos, placas petri o
frascos. Algunos modelos incorporan en su interior una toma de corriente para poder acoplar un agitador de vaivén o magnético. De esta forma se favorece, por ejemplo, el desarrollo de cultivos de levaduras en mosto.
Estas estufas deben de asegurar una temperatura estable, con una tolerancia máxima de más menos
0,5 ºC, por lo que se equipan con sistemas de regulación bastante precisos.
En cuanto a los requerimientos gaseosos de los microorganismos de interés enológico, deberás de tener en cuenta si se trata de microorganismos
aerobios,
anaerobios o
microaerófilos.
El aire del laboratorio es suficiente para incubar microorganismos aerobios, pero no permite el cultivo de los anaerobios.
Cuando se pretende incubar microorganismos anaerobios, además de garantizar la TCO, deberás de generar una ambiente exento de oxígeno, mediante alguno de los métodos siguientes:
- Cámara de Anaerobiosis: Muy caras para un laboratorio enológico.
- Jarras de Anaerobiosis: Se trata de recipientes cilíndricos, de metal o de plástico rígido, con cierre hermético, en los que la atmósfera anaerobia se genera al introducir unos sobres (GasPak®, Becton Dickinson) que liberan
hidrógeno y
dióxido de carbono al añadir agua. El hidrógeno se combina con el oxígeno existente, formando agua en presencia de un catalizador. Actualmente existen sistemas en los que no hace falta añadir agua ni catalizador (Anaerogen®, Oxoid). Debe de introducirse algún sistema de detección del oxígeno (tiras que se decoloran al desaparecer la presencia del oxígeno). Puedes hacer un sistema más casero, introduciendo una vela en un frasco de vidrio con tapa.
- Bolsas Plásticas: Existen en el mercado diferentes sistemas de bolsas de anaerobiosis de plástico transparente y flexible, como GasPack Pouch® (Becton Dickinson) o AnaerogenCompact® (Oxoid) que generan un ambiente de anaerobiosis y llevan el indicador incorporado.
CONTROL DE MICROORGANISMOS (DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN)Se entiende por control, la muerte, eliminación o inhibición de la actividad de los microorganismos, entendiendo por muerte la pérdida irreversible de la capacidad de reproducción.Se puede eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos por diversos procedimientos físicos y químicos, aunque aquí solo se tratarán aquellos que son más comunes en un laboratorio enológico.
Dentro de los métodos físicos el más utilizado en el laboratorio es el control por temperaturas altas y la filtración.
Se conoce como tiempo de muerte térmica, al tiempo mínimo necesario para matar una suspensión de bacterias o esporas en unas condiciones determinadas.
Se define el tiempo de reducción decimal, como el tiempo en minutos necesario para reducir la población microbiana en un 90 %.Los sistemas de control por temperaturas altas son:
- Métodos de Calor Seco: El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación. En el laboratorio se aplica cuando exponemos los microorganismos directamente a la llama de un mechero o al introducirlos en un horno a
150-180 °C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente en la esterilización de asas de siembra y todo tipo de material de vidrio.
- Métodos de Calor Húmedo: Utiliza el vapor de agua a una temperatura elevada, siendo el método más práctico y utilizado. Se lleva a cabo en el
autoclave, aparato en el que se puede mantener una presión y temperatura controlada durante un determinado tiempo. A nivel de laboratorio se suele utilizar un tiempo entre 15-20 minutos, siendo la temperatura de 121ºC y 1 atm de presión.
Este método con humedad elevada y alta penetración provoca una fácil coagulación de las proteínas, y es empleado para esterilizar casi todo el material y medios del laboratorio.
- Tindalización: Se trata de un calentamiento con vapor a 100 ºC durante 3 días, tiempo en el cual se intercalan periodos de incubación a la temperatura de crecimiento óptimo del organismo tratado.
Es empleado para material y medios que no resisten los 121ºC, así como para esporas resistentes al autoclave. Al germinar las esporas en los periodos de incubación, en el posterior calentamiento las células vegetativas son destruidas.
- Sistema de Control por Filtración: La
esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. Es utilizada para
materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos etc.
En el laboratorio se suelen usar
filtros de membrana de filtración en superficie, cuyo material filtrante es a base de
acetato o
nitrato de celulosa. Presenta la ventaja de tener los poros de
diámetro bastante uniforme, lo que permite seleccionar diferentes tipos de filtro en función de los microorganismos. Para esterilización total se usa el filtro de
0,22 micras.
DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓNLa esterilización es un método de eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.-
Desinfectante: Es un agente que mata los microorganismos, pero no necesariamente sus esporas, que no debe aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc.
Algunos ejemplos son: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc.
- Antiséptico: Es un agente microbicida que puede aplicarse sobre la piel y las mucosas, pero no pueden ser utilizados internamente.
Algunos ejemplos son: el nitrato de plata, las soluciones de yodo, los alcoholes, los detergentes etc.
La diferencia entre desinfectante y antiséptico estriba en la posibilidad de ser, o no ser usados de forma segura sobre membranas mucosas (nariz, boca, tracto gastrointestinal).
Muchas veces esta seguridad depende de la
concentración del agente, como ocurre con el cloro, que dependiendo de su concentración, puede ser agregado al agua potable.
También es utilizado el término
sanitizer (término en lengua inglesa) o
sanitizante (adaptado de la palabra inglesa) para definir a un agente que
reduce el número de microorganismos a un nivel seguro (mata el 99,99 % de los microorganismos en 30 segundos). Pero su uso, aunque bastante extendido, genera mucha confusión y no aparece en ningún diccionario de la lengua española.
- Conservante: Es un agente usado frecuentemente en alimentos, pero también en productos farmacéuticos, que
inhibe el crecimiento de microorganismos. Por lo tanto no puede resultar tóxico por ingestión.
Aún así, ante la posibilidad de que pueda generar intolerancias, existe la obligación de informar de su contenido al consumidor de los productos tratados. Es la razón por la que las etiquetas de los vinos deben de informar sobre la presencia de sulfitos.
Algunos ejemplos son: El propionato de calcio, el benzoato de sodio, el formaldehído o el dióxido de azufre.
La acción de desinfectantes y antisépticos depende de varios factores, entre ellos:
- La concentración del agente químico.
- La temperatura a la cual es usado.
- La clase de microorganismos presente.
- El número de microorganismos presentes.
- La naturaleza de material que acompaña a los microorganismos (materia orgánica, etc.).
El mejor resultado se obtiene cuando el número inicial de microorganismos es bajo y la superficie a desinfectar está limpia y libre de sustancias que interfieran.
EQUIPOS DE LABORATORIO- Autoclave: Se compone de un recipiente construido en acero inoxidable, con paredes gruesas y aisladas del exterior, además de un
cierre hermético que permite someter al material que se deposite en su interior a
temperaturas y
presiones elevadas. En el laboratorio se utiliza para esterilizar diversos tipos de materiales y medios, mediante la técnica de calor húmedo, por vapor de
agua a presión elevada. Hay que destacar que no es válido para todos los materiales, pues el papel o muchos plásticos (excepto el polipropileno) son destruidos o alterados en el proceso.
El vapor de agua a alta temperatura y presión, presenta un
elevado poder de penetración, lo que provoca la
coagulación de las proteínas microbianas y por lo tanto su destrucción.
Su fundamento y funcionamiento es semejante a una olla a presión, aunque un poco más sofisticado. De hecho, algunos equipos de laboratorio de pequeño tamaño se asemejan mucho a este objeto de menaje de nuestras cocinas.
Los autoclaves deben de estar equipados con un
sistema de regulación y
control de temperatura, así como un dispositivo para comprobar la presión en su interior. Además desde el más simple al más sofisticado, llevan una válvula de seguridad que se abrirá al sobrepasar una determinada presión, evitando así la explosión del equipo. Es conveniente que, además, lleven un termostato y un presostato de seguridad.
Los equipos más modernos llevan otros accesorios como programadores, sistemas de vacío para secado del material después de esterilizado, purgado atmosférico automático, etc.
Las condiciones estándar de esterilización son
121 ºC y una
atmósfera de presión durante un tiempo de 20 minutos.- Horno Pasteur: Es utilizado para esterilizar materiales metálicos o de vidrio, mediante calor seco. También se conoce como
estufa poupinell y consiste en un recinto metálico a modo de armario, con doble pared y material aislante entre ambas y una puerta de cierre hermético. La fuente de calor suele ser mediante una
resistencia eléctrica que está incorporada a la estructura, entre las dos paredes. Posee un ventilador que facilita la circulación del aire caliente para lograr una temperatura homogénea en el interior. La regulación de la temperatura se realiza mediante termorreguladores hidráulicos o mediante una termorresistencia regulada por un circuito electrónico.
Para esterilización se debe mantener una temperatura de
160-170 ºC durante 2 horas.
- Equipos de Filtración: Existe una gran diversidad de equipos de filtración esterilizante para el laboratorio, construidos en materiales plásticos, de vidrio o metálicos. Todos ellos admiten los filtros de membrana de tamaño estándar y diferentes tamaños de poro, aunque para esterilización se debe de utilizar un
filtro de 0,22 micras.Es importante que tengas en cuenta que los filtros se comercializan estériles, por lo que al manejarlos debes de impedir su contaminación. La esterilización del equipo para su uso, dependerá del material de construcción.
PROCEDIMIENTO DE USO DEL AUTOCLAVEEl autoclave es uno de los equipos de control microbiológico más habituales en laboratorios enológicos, pero existen muchos modelos, aunque el funcionamiento es similar. Por ello existe un procedimiento genérico, aunque es recomendable leer con atención el manual de funcionamiento, que debe de estar siempre accesible en el laboratorio.
Procedimiento:
1. Envuelve en papel de aluminio, las puntas de pipeta, las asas de siembra de plástico esterilizable, las pipetas pasteur, las pinzas y otros materiales que no vas a utilizar inmediatamente.
2. Si vas a esterilizar medios de cultivo, bien en frascos de autoclave o en tubos de ensayo, procura que los tapones correspondientes
no estén totalmente roscados, ya que podrían romperse por la presión.
3. Pon el material a esterilizar en el interior de la cesta metálica del autoclave, de forma ordenada y separada. Comprobar que el agua del depósito tiene el
nivel adecuado. En autoclaves pequeños y de sobremesa, el agua se pone en el fondo, de manera que no supere la rejilla de separación.
4. Mete la cesta en el autoclave y cierra la puerta, asegurándote de que el cierre sea hermético, ya que las juntas de goma se deterioran con el paso del tiempo.
5.
Abre la válvula de salida de vapor.6. Si el autoclave dispone de programador, comprueba que los parámetros programados son los adecuados. De no ser así, vuelve a programar, ajustando la temperatura a
121 ºC, la presión a
1 atmósfera y el tiempo a
20 minutos.
7. Acciona el interruptor de encendido para que se inicie la calefacción del agua y
espera a que el vapor de agua salga por la válvula de forma continua. Es necesario que elimines el aire del interior, para garantizar que el vapor de agua ocupe la totalidad del espacio interior.
8. Cierra la válvula y comprueba que la presión y temperatura aumentan su valor, hasta alcanzar 1 atmósfera 121 ºC.
9. A partir de este momento se inicia el periodo de esterilización. Si no dispone de programador deberás de contabilizar el tiempo a partir de este momento con ayuda de un cronómetro.
10. Una vez finalizado el tiempo programado,
apaga el interruptor y abre la válvula de salida del vapor. Recuerda que es conveniente que esta válvula se conecte a una
salida exterior para evitar que el vapor sature el laboratorio.
11. Cuando deje de salir vapor y la temperatura haya descendido a
50-60 ºC, puedes abrir la puerta y sacar la cesta metálica con guantes antitérmicos.
12. Ajusta o
aprieta los tapones de los frascos con medio de cultivo.
13. Coloca el material esterilizado en el lugar adecuado, consciente de que el orden es fundamental en el laboratorio de microbiología.
14.
Limpia el interior y exterior del autoclave y déjalo preparado para su próximo uso.
En la mayoría de los equipos actuales estas fases se realizan de forma automática, por lo que sólo es necesario cerrar el aparato y accionar el interruptor, pues el cierre de la válvula se hace una vez que se expulsó todo el aire y el temporizador se inicia cuando en el interior se alcanzan las condiciones prefijadas. Al finalizar el proceso, se desconecta y expulsa el vapor, emitiendo un sonido cuando el operario pueda abrirlo.
La contabilidad del tiempo de esterilización se inicia cuando la presión alcanza el valor de 1 atmósfera y la temperatura los 121 ºC. EXTRACCIÓN, PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE MUESTRASPara poder obtener una
muestra representativa y
homogénea de la población microbiana de cualquier área o producto de una explotación vitivinícola, el primer paso será diseñar un
plan de muestreo, teniendo en cuenta todos los aspectos ya estudiados. Este plan será muy distinto para una bodega pequeña o para una gran bodega, en la que será necesario recurrir a muestreos estadísticos.
En principio, el control microbiológico se referirá al proceso de elaboración y conservación de vinos, dejando la parte correspondiente a la microbiología aplicada a la viticultura, centrada en los microorganismos relacionados con las enfermedades de la vid.
Por lo tanto, se explica la metodología de extracción de muestras, que se centrará en:
- Los locales y equipos de elaboración, como áreas de recepción, fermentación y envasado de una bodega.
- Los productos durante todo el proceso de elaboración, desde el mosto al vino envasado.
- Los productos acabados y auxiliares.- El agua de abastecimiento.En caso de
elaboraciones especiales (método champanoise, crianza biológica, etc.) o elaboración de otros
productos derivados (vinagres y otros), el muestreo se adaptará a las necesidades concretas del proceso y el producto.
En todo caso, el procedimiento debe de evitar la contaminación de la muestra con microorganismos ajenos a los propios del producto muestreado, tanto durante el proceso de extracción como en el de transporte.
Resulta imprescindible que las muestras sean
perfectamente identificadas, sin dar lugar a confusión y anotando claramente de que producto se extrae,
lugar y fecha de la extracción y persona que lo realiza.
TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOSMuestreo de Superficies: Para muestreo de paredes, desagües o equipamiento, recurriremos a la toma de muestra de superficie. Para ello utilizaremos alguno de estas técnicas:
1.
Hisopos de Celulosa Estériles: Un hisopo es un
bastoncillo largo acabado en una punta de algodón o celulosa.
El procedimiento consiste en
pasar el hisopo (también llamado torunda)
por la superficie, para después introducirlo en un tubo que puede contener:
- Una
solución tampón, para transportar la muestra al laboratorio y proceder con cualquier técnica de análisis.
- Un
medio específico con un tinte indicador, que se puede incubar directamente según un protocolo. En algunos casos son muy sensibles y basta con un solo microorganismo para provocar un cambio de color.
2.
Placa con Medio de Cultivo: Las
placas de contacto son placas de cultivo especiales en las que la
superficie del medio es convexa. Existen diferentes tipos de placas de contacto, pero las más utilizadas son las placas RODAC, en cuya base llevan grabada una cuadrícula de superficie determinada, que facilitará el recuento del número de colonias. El resultado se expresa en ufc/cm2. Para su utilización, se saca la tapa, se presiona sobre la superficie, procurando que
toda la superficie del medio entre en contacto, se incuba y se hace el recuento.
Otro modelo son las placas Petrifilm, de medio deshidratado sobre papel y con cuadrícula. Para su uso se hidratan con diluyente estéril y se procede igual que con las anteriores.
La principal
ventaja de este método es su sencillez, presentando el inconveniente de que superficies muy sucias van a provocar un número muy elevado de colonias. Además no se adaptan bien a superficies rugosas.
3.
Laminocultivos o Paletas de Agar: Dispositivo en forma de
paleta con medio de cultivo sólido adherido. Puede llevar un medio diferente por cada lado. La paleta se introduce en un tubo roscado a medida, en el cual se cultiva y se hace el recuento.
4.
Cintas Adhesivas: El método es muy sencillo y consiste en
atrapar en la cinta las partículas depositadas en una superficie y observarla al microscopio. Tan solo permite evaluar el tipo de microorganismo, pero no su cantidad.
Muestreo de Líquidos: Para
muestrear líquidos, como pueden ser mosto, vino o agua, es suficiente con
cualquier recipiente de laboratorio previamente
esterilizado. Es preferible que tenga tapa.
Para extraer la muestra puedes utilizar pipetas estériles o bien hacerlo directamente de los grifos, válvulas y catavinos, siempre y cuando se esterilicen previamente mediante la llama de un mechero. De esta forma lograrás evitar la contaminación por los posibles microorganismos residentes en ellos. Antes de tomar la muestra has de dejar salir un poco de líquido.
Una vez en el laboratorio se hacen las diluciones correspondientes.
MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAEsta rama de la microbiología, se dedica al estudio de los microorganismos relacionados con los procesos de elaboración de vinos y algunos de sus derivados.
Como rama de la microbiología, hay que tener en cuenta qué microorganismos intervienen en cada proceso, sean
beneficiosos o
perjudiciales; conocer también su
morfología y
fisiología y las
condiciones de desarrollo de los mismos. Prestar especial atención a sus
requerimientos nutricionales y a las
condiciones físicas que necesita.
Dado que su hábitat es el vino o el mosto, esta disciplina deberá de profundizar en
la interacción entre los microorganismos y el medio, analizando las consecuencias de la actividad microbiana y los metabolitos resultantes de la misma.
Así, los principales grupos de microorganismos estudiados por la microbiología enológica son:
Levaduras: Son las responsables de los
procesos de fermentación del mosto para convertirlo en vino, pero también existen otras levaduras cuya presencia implica la
aparición de compuestos no deseados. Las levaduras de interés enológico se dividen en diferentes grupos:
- Levaduras de Fermentación Tipo A: Que fermentan el mosto hasta agotar los azúcares, entre las que encontramos a Saccharomyces cerevisae raza cerevisaey raza bayanus.
- Levaduras de Fermentación Tipo B: También llamadas levaduras de flor. Estas levaduras son las responsables de la crianza biológica de los vinos del sur de España, como Saccharomyces beticus o Saccharomyces cheresiensis.
- Levaduras de Alteración: Cuya actividad provoca alteraciones o enfermedades en los vinos. Algunos ejemplos de este grupo de levaduras son Candida vini o Hansenula anomala, responsables de la formación de la llamada flor del vino y de producir ácido acético y acetato de etilo.
Bacterias Lácticas: Dentro de este grupo de microorganismos, se encuentran los responsables de
conducir la fermentación maloláctica y por lo que se trata de microorganismos importantes para el proceso de elaboración. Quizás el más representativo sea
Oenococcus oeni. Pero también existen otras bacterias lácticas cuya presencia da origen a productos no deseados, por lo que deben de evitarse en la bodega.
Bacterias Acéticas: Salvo en el caso de la elaboración de vinagres, la presencia de este grupo de microorganismos supone un quebradero de cabeza para los responsables del proceso de elaboración de vino. Representantes de este grupo son entre otras Acetobacter aceti.
Hongos Filamentosos: Como responsables de enfermedades que afectan al cultivo de la viña, su presencia y efectos pueden pasar al mosto y afectar al proceso de elaboración, como Botryitis cinerea.
LEVADURAS DE INTERÉS ENOLÓGICOLas levaduras son hongos unicelulares. El término levadura designa un grupo dispar de organismos distribuidos en tres grupos taxonómicos diferentes:
Ascomicetos,
basidiomicetos y
hongos imperfectos, aunque las levaduras de interés enológico pertenecen solamente a los
ascomicetos y a los
hongos imperfectos. En los Ascomicetos las esporas están contenidas en ascas, es decir una especie de sacos formados a partir de la levadura. Las levaduras en las cuales no se pudo evidenciar un modo de reproducción sexuada, están clasificadas entre los Hongos Imperfectos.
En el cuadro de la imagen adjunta, se enumeran los géneros de levaduras más comunes en las uvas, mostos y vinos:
La taxonomía y la morfología de las levaduras, es estudiada en el módulo de Procesos bioquímicos, al igual que la secuencia de levaduras que intervienen en el proceso de fermentación de un mosto y la importancia relativa que reviste cada una de ellas.
El objetivo se centra en que sepamos aplicar algunos de los procedimientos técnicos de interés en un laboratorio enológico, tanto para
contribuir a la identificación y clasificación de las levaduras, como para
evaluar sus aptitudes enológicas.Así pues se exponen procedimientos de:
- Pruebas Fisiológicas: Se trata de procedimientos técnicos de laboratorio, cuya finalidad es contribuir a la
identificación y
clasificación de las levaduras que puedas encontrar en la bodega y en el entorno productivo.
- Pruebas de Caracterización y Selección: En este caso los procedimientos técnicos de laboratorio que vas a desarrollar, tienen como objetivo conocer algunas de las
aptitudes enológicas que desarrollan las levaduras y realizar la selección de aquellas que presenten un mayor interés.
PRUEBAS FISIOLÓGICASEstas pruebas nos sirven para identificar qué género y especie de levadura es la que estamos estudiando y no llevarnos sorpresas inesperadas en los procesos de fermentación.
Existen diversas pruebas fisiológicas asociadas a la identificación de las levaduras presentes en los mostos y vinos, algunas de las cuales necesitan un equipamiento bastante sofisticado. Pero también podemos encontrar pruebas en las que el equipamiento necesario es compatible con un laboratorio enológico sencillo.
- Fermentación de Azúcares: Las levaduras con interés en enología, presentan una capacidad diferente a la hora de fermentar los azúcares presentes en un mosto. Así, algunas fermentan con buen rendimiento la sacarosa, mientras que otras lo hacen de manera deficiente o simplemente no fermentan ese azúcar. Por ejemplo
Kloeckera apiculata o
Cándida pulcherrima, sólo fermentan la glucosa, mientras que
Saccharomyces ellipsoideus Fermenta: Glucosa; Sacarosa; Maltosa y
Rafinosa; pero
no fermenta la Lactosa. - Asimilación de Azúcares: Algunas levaduras, aunque no fermenten un determinado azúcar, pueden asimilarlo metabolizándolo por vía oxidativa.
En aquellas levaduras que no han fermentado ningún azúcar, es conveniente comprobar si son capaces de asimilarlos.Hay levaduras que asimilan los mismos azúcares que fermentan, como ocurre con
Torulopsis bacillaris o muchas de las
Saccharomyces.
- Formación de Esporas: Cuando el medio ambiente es desfavorable las
levaduras ascomicetes recurren a la
reproducción sexual. Este hecho se observa porque la célula de la levadura se transforma en un asca con varias ascosporas en su interior.
Este fenómeno constituye una
característica de valor taxonómico, ya que permite clasificar una levadura en la familia
Saccharomycetaceae o en la familia
Cryptococcaceae.
El
número de esporas varía de una a ocho e incluso más, pero en general su número se limita a
cuatro, ya que estas esporas son el resultado de una meiosis. Las esporas pueden permanecer en el interior de las células o ser expulsadas.
- Formación de Velo: Las
levaduras filmógenas son las levaduras de alteración más extendidas. Estas levaduras se desenvuelven
sobre la superficie del vino que está en contacto con el aire, formando un
velo. La forma más frecuente de alteración es la
flor.
La flor es una alteración producida por levaduras de metabolismo oxidativo estricto. Por lo tanto este fenómeno aparece
cuando el vino está en contacto con el aire. Las cepas más frecuentes pertenecen a los géneros
Candida,
Pichia y
Hansenula, aunque también intervienen otras como
Zygosaccharomyces,
Rhodotorula y
Brettanomyces.
Caso bien distinto es la formación de velo en los
vinos de crianza biológica, en la que las levaduras implicadas pertenecen mayoritariamente al género Saccharomyces.
La proliferación de unas u otras está en función del
grado alcohólico del vino y de
su tolerancia al etanol. Así las levaduras utilizadas en crianza biológica son más tolerantes al etanol (mayor del 13%), mientras que las menos tolerantes, son levaduras de alteración.
- Formación de Seudomicelio: Es frecuente observar en algunas especies, que después de la gemación las células hijas permanecen unidas unas a otras formando cadenas de varias células. Se trata de un
seudomicelio, que puede ser rudimentario formado por cuatro a cinco células, o más desarrollado, bien formado y con ramificaciones. A menudo las células centrales se alargan y forman un
eje principal, mientras que las de los extremos permanecen cortas y forman blastosporas. La
producción de seudomicelio está favorecida por la anaerobiosis. Algunas levaduras como
Candida pulcherrima, forman seudomicelio, sirviendo como característica de identificación de las mismas.
FERMENTACIÓN DE AZÚCARESDe los azúcares presentes en un mosto, no todos ellos son utilizados por las levaduras y además existen diferencias de capacidad de fermentación según de qué levadura se trate. Por ello es interesante conocer cómo se realiza esta prueba y aplicarla a la identificación de las levaduras presentes en un mosto.
Objeto: El objeto de este procedimiento, es determinar qué azúcares es capaz de fermentar una levadura determinada. Se aplica a todas las levaduras de interés enológico.
Material y Reactivos:- Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
- Campana Durham.
- Pipetas 10 ml.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Medio para la fermentación de azúcares:
- Yeast Nitrogen base. 0,67 g.
- Azúcar a examen. 2,00 g.
- Agua destilada. 100 ml.
- Cultivo reciente de la levadura ensayada (48 horas).
Procedimiento:- Prepara el medio con las proporciones indicadas, siguiendo el procedimiento general para preparación de medios de cultivo y ensayando diferentes azúcares.
- Reparte en tubos de ensayo dispuestos en una gradilla metálica, poniendo aproximadamente 10 ml en cada tubo. Puedes medir el volumen del primer tubo y llenar los siguientes por comparación o usar una pipeta automática
- Pon en cada tubo una
campana Durham.- Esteriliza los tubos, en la gradilla, en autoclave a 0,5 atmósferas durante 15 minutos.
- Una vez esterilizados, sácalos del autoclave deja que enfríen y
siémbralos por duplicado con las levaduras a ensayar, trabajando en campana de flujo laminar.
- Incuba a 28 ºC durante 15 días.- Observa si hay
enturbiamiento y se
acumula gas en las campanas Durham.
Interpretación de Resultados:Si la levadura fermenta el azúcar ensayado, presentará enturbiamiento del medio y acumulación de gas en la campana Durham, por lo que éste será el indicador que demuestre si hubo o no fermentación. ASIMILACIÓN DE AZÚCARESCuándo una levadura no fermenta un determinado azúcar. Puede ser por varias razones, ya puede que tampoco sea capaz de metabolizarlo para su desarrollo. Pero en algunos casos, la levadura presenta la capacidad de asimilarlo aunque no lo fermente. Éste es un parámetro que también nos sirve para la clasificación de las levaduras enológicas y es fácil de realizar.
Objeto: El objeto de este procedimiento, es determinar la capacidad que presentan las levaduras para asimilar distintos azúcares. Se aplica a levaduras que no son capaces de fermentar ningún azúcar, para comprobar su capacidad para metabolizarlos por vía oxidativa.
Material y Reactivos:- Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
- Pipetas 10 ml.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Medio para asimilación de azúcares:
- Yeast Nitrogen base. 0,67 g
- Azúcar a examen. 1,00 g
- Agar. 2,00 g
- Agua destilada. 100 ml
- Cultivo reciente de la levadura ensayada (48 horas).
Procedimiento:- Prepara el medio con las proporciones indicadas, siguiendo el procedimiento general para preparación de medios de cultivo y ensayando diferentes azúcares.
- Reparte en tubos de ensayo dispuestos en una gradilla metálica, poniendo aproximadamente 7 ml en cada tubo. Puedes medir el volumen del primer tubo y llenar los siguientes por comparación o usar una pipeta automática.
- Esteriliza los tubos en la gradilla, en autoclave a 121 ºC y 1 atmósfera, durante 15 minutos.
- Una vez esterilizados, sácalos del autoclave y colócalos en posición inclinada para que solidifiquen en slant o pico de flauta.
- Dentro de la campana de flujo laminar, o bajo la protección de la llama del mechero,
realiza una siembra por estría en la superficie del medio, utilizando un asa de siembra o una punta de pipeta estéril, partiendo del cultivo reciente de la levadura ensayada.
- Realiza tantas siembras como levaduras pretendas ensayar, recomendándote realizar el ensayo por duplicado.
- Incuba a 28 ºC durante 15 días, aunque el crecimiento ya se observa a partir del 5º día.
Interpretación de Resultados: Si la levadura asimila el azúcar ensayado, presentará crecimiento en el tubo correspondiente.
FORMACIÓN DE ESPORASLa formación de esporas es un sistema de defensa de las levaduras ante una situación adversa, también se puede provocar en el laboratorio esta situación para conseguir que las levaduras produzcan esporas y así poder estudiar sus características.
Objeto: El objeto de este procedimiento es
determinar si una levadura es esporógena, es decir, si produce esporas y es aplicable a todos los géneros de levaduras.
Material y Reactivos:- Placas petri.
- Asa de siembra.
- Portaobjetos y cubre objetos.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Microscopio.
Medio de Preesporulación:- Glucosa 5,0 g.
- Extracto de levadura 1,0 g.
- Nutrient Broth 3,0 g.
- Agar 2,0 g.
- Agua destilada 100 ml.
Medio de Esporulación:- Potasio acetato 98 g.
- Glucosa 0,10 g.
- Extracto de levadura 0,25 g.
- Agar 2,00 g.
- Agua destilada 100 ml.
Tinción de Esporas:- Solución de verde malaquita.
- Solución de safranina.
Procedimiento:- Prepara los medios y esterilízalos en autoclave a 121 ºC y 1 atmósfera durante 15 minutos, usando frascos de boca ancha.
- Una vez esterilizados,
prepara placas de los dos medios, siguiendo el protocolo específico.
- Siembra las levaduras a ensayar en las placas con medio de
preesporulación.- Cultiva durante 2 días a 28 ºC.- Partiendo de las cepas que crecieron en este medio,
siembra las placas con el medio de esporulación.- Incúbalas a 23 ºC durante 5 días.- Pasado este periodo,
haz una preparación en fresco y obsérvala al microscopio.- En caso de duda, realiza una
tinción de esporas.- Calcula el % de células esporuladas por conteo.
Interpretación: Las esporas se pueden diferenciar
por su color, por el
aspecto de su pared (lisa o rugosa) o por
su forma, que puede ser redondeada, ovalada, arriñonada, falciforme, forma de sombrero, hemisférica, etc.
Algunas levaduras se transforman en clamidosporas mediante la formación de una gruesa pared alrededor de la célula (especies del género
Candida,
Rhodotórula y
Criptococcus).
FORMACIÓN DE VELOLos vinos de crianza biológica producidos en el sur de España, en su elaboración intervienen una serie de levaduras formadoras de velo, que caracterizan este interesante tipo de vinos. Pero otras levaduras formadoras de velo, generan alteraciones en la superficie del vino.
Objeto: El objeto de este procedimiento es determinar si una levadura es filmógena, es decir, si produce un velo sobre a superficie del vino.
Material y Reactivos:- Tubos de ensayo de 16 x160 mm.
- Pipetas 10 ml.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Mosto comercial.
- Sacarosa.
- Hidróxido de sodio.
- Cultivo de levadura 48 horas.
Procedimiento:- Prepara un mosto de uva de 8º Baumé a partir de un mosto comercial.
- Ajusta el valor del pH a 5.- Reparte 10 ml en cada uno de los tubos de ensayo de 16 x 160 mm.
- Esteriliza en el autoclave a
121 ºC y 1 atmósfera de presión durante 20 minutos.
- Prepara una zona de trabajo estéril o enciendo previamente la campana de flujo laminar.
- Realiza una siembra en el mosto contenido en los tubos, utilizando un asa de siembra estéril.
De cada levadura que pretendas ensayar, inocula dos tubos (prueba por duplicado).
- Incuba los tubos inoculados a
21 ºC durante una semana.
- La primera observación ya la puedes hacer a las 48 horas, aunque lo normal es que observes el velo a los 5 ó 7 días.
- Es importante que hagas una
observación diaria, pues algunas levaduras (fermentativas) provocarán la fermentación del medio en 24 ó 48 horas.
- Anota el resultado de la siguiente forma:
1. Presencia de velo con signo +.2. Presencia de islotes con signo i.3. Ausencia de velo con signo -.Interpretación de Resultados: Las levaduras filmógenas son las levaduras de alteración más extendidas. Éstas se desarrollan sobre la superficie del vino que está en contacto con el aire, formando un velo.La
flor es una alteración producida por levaduras de metabolismo oxidativo estricto; por lo tanto este fenómeno aparece cuando el vino está en contacto con el aire. Las cepas más frecuentes pertenecen a los géneros
Candida,
Pichia y
Hansenula aunque también intervienen otras como
Zygosaccharomyces,
Rhodotorula y
Brettanomyces.
FORMACIÓN DE SEUDOMICELIOAlgunas levaduras poseen la capacidad de producir ramificaciones seudomiceliares y éstas se utilizan como parámetro para su identificación.
Objeto: El objeto de este procedimiento es
comprobar si una levadura produce ramificaciones seudomiceliares, siguiendo la técnica de Rivalier – Seydel (1932).
Material y Reactivos:
- Placas petri.
- Papel de filtro
- Tubo de vidrio acodado
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Tijeras.
- Medio de cultivo agar-malta.
- Cultivo de levadura de 48 horas.
- Agua estéril.
Procedimiento:- Coloca un círculo de papel absorbente en el fondo de una placa petri.
- Sobre el papel coloca
un trozo de tubo de vidrio acodado, y sobre éste coloca un portaobjetos.
- Esteriliza el conjunto en un
horno pasteur durante 2 horas a 120 ºC.
- Prepara un poco de medio
agar malta y esterilízalo. Si ya lo tienes preparado, lícualo a baño maría.
- Genera una zona estéril con un mechero o enciende la campana de flujo laminar.
- Vierte unas gotas de medio sobre el porta, manteniendo la placa abierta el tiempo imprescindible.
- Deja que solidifique el medio sobre el porta.
- Realiza una
siembra por estría sobre el medio, con las levaduras a ensayar.
- Vierte un poco de agua estéril sobre el papel, para
mantener la humedad ambiente dentro de la placa petri.
- Con mucho cuidado ponlo en la estufa de incubación y
fija una temperatura de 22 ºC.- Las posibles ramificaciones se observarán entre los
15 y los 30 días.- Observa al microscopio, procurando enfocar el borde del cultivo, sobre el que habrás puesto un cubreobjetos.
Interpretación de los Resultados: El seudomicelio se observa en el borde del cultivo y en ocasiones se puede ver a simple vista.
Frecuentemente las células del seudomicelio
son distintas entre si.Normalmente está constituido por una
cadena de células que forman la estructura fundamental; son grandes y alargadas y en sus verticilos aparecen otras células más pequeñas, que son las llamadas blastosporas.
Dependiendo de la forma, disposición y estructura de las blastosporas, pueden distinguirse tres tipos de seudomicelios:
- Tipo Micocándida: Con blastosporas redondas o alargadas, más o menos ramificadas, es decir, con cadenas de más de dos elementos.
- Tipo Micotórula: Con blastosporas redondas y con disposición axial en los verticilos, aparentando como racimos de células redondas.
- Tipo Blastodendrium: Con blastosporas alargadas y ramificadas en los verticilos.
PRUEBAS DE CARACTERIZACIÓN Y SELECCIÓN DE LEVADURASCaracterizar es conocer y valorar cuales son sus pautas de comportamiento en un proceso fermentativo. Cuando estas características son conocidas, se utilizan como criterios de selección para elegir aquella levadura que más se ajusta a un determinado proyecto de elaboración.
Los criterios básicos de selección de levaduras, se basan en lograr:
1.
Elevado Poder Fermentativo: Lo que implica producción y tolerancia al etanol y ausencia de problemas de acabado.
2.
Baja Acidez Volátil: O lo que es lo mismo poca producción de ácido acético y acetato de etilo.
3.
Correcta Cinética Fermentativa: Con un rápido arranque y acabado, una fermentación regular y buena resistencia al estrés fermentativo.
A estos criterios se pueden añadir la tolerancia al dxióxido de azufre o la ausencia de defectos olfativos.
A nivel de laboratorio, se pueden realizar diversas pruebas de caracterización:
- Poder Fermentativo: Se entiende por poder fermentativo o poder alcoholígeno al máximo porcentaje de etanol que una levadura es capaz de producir, al fermentar un mosto estéril con exceso de azúcares, con una graduación Baumé igual o superior a 12 ºBé (212 g/l de azúcar).Su determinación se basa en provocar una fermentación en el laboratorio mediante el inóculo de la levadura en estudio en 50ml de mosto estéril en un matraz erlenmeyer que se cierra con una válvula tipo Müller que contiene H2SO4 que impide la salida de productos volátiles de la fermentación pero deja salir el CO2 y así calcular el rendimiento del proceso mediante un cálculo gravimétrico, por diferencia de pesada (entre la pesada del matraz una vez inoculado y la pesada del matraz una vez concluida la fermentación). Con esto obtenemos la cantidad de CO2 producido en la fermentación de 50ml de mosto.
La diferencia de peso obtenida, al pesar antes y después de la fermentación, se relaciona con la cantidad de etanol producido,
mediante un factor de valor 2,5. Este factor se deduce de la reacción:
C6H12O6 → 2 CO2 + 2 CH3-CH2OH
Es decir que al fermentar 180g de glucosa se forman 88g de CO2 y 92g de etanol (CH3-CH2OH)
El valor del factor 2,5 se obtiene de las siguientes deducciones:
- 180 g de glucosa producen al fermentar 88 gramos de CO2 y 92 gramos de etanol. Por lo tanto, a 1 gramo de CO2 le corresponden 1,04 g de etanol. La densidad del etanol es 0,79 gramos/cm3, por lo que 1,04 g de etanol ocupan un volumen de 1,3 ml.
- La diferencia de peso en gramos (p) multiplicada por 1,3 dará el volumen de etanol producido.
50 ml de mosto →
1,3 multiplicado por
p ml de etanol.
100 ml de mosto → X ml de etanol.
X = 1,3 x 100 x p/50 = 2,6 p.
Se utiliza 2,5 por existir una
contracción de volumen al mezclarse el alcohol producido con la solución acuosa.
- Tolerancia al Etanol: La tolerancia al etanol es una característica de
gran importancia para la etapa final de fermentación, cuando ya existe un porcentaje elevado de etanol. Cuando las levaduras son poco tolerantes no son capaces de finalizar el proceso, lo que implica que nos queden en el vino una cantidad de
azúcares reductores. Estos azúcares pueden resultar
peligrosos para la estabilidad del vino.También en el caso de
paradas fermentativas es importante conocer la tolerancia al etanol de las levaduras. Cuando esto ocurre, es necesario seleccionar una
levadura tolerante para volver a arrancar el proceso en un medio en que ya existe un determinado porcentaje de etanol.
- Floculación: En la caracterización enológica de una cepa de levadura se buscan cualidades que resulten interesantes en el proceso de vinificación. El
carácter floculante de una levadura favorece los procesos de sedimentación durante la clarificación del vino. Esto se busaca sobre todo en las cepas utilizadas en la segunda fermentación de los vinos espumosos mediante el método tradicional (champenoise) con el fín de facilitar el degüello.
Las
cepas floculantes producen una o varias proteínas, que provocan la adhesión entre células vecinas para formar
agregados o
flóculos. Esta propiedad determinada genéticamente, depende de la cepa de levadura y se expresa bajo ciertas condiciones.
PODER FERMENTATIVOHoy en día el uso de las levaduras comerciales (LSA), esta ya muy generalizado. Una de las propiedades que se les atribuyen, es su elevado poder fermentativo.
Objeto: El objeto de este procedimiento es determinar el
poder fermentativo de una levadura, siendo aplicable a todos géneros de levaduras, aunque como es lógico sólo se hace con las que presentan interés enológico.
Material y Reactivos:- Matraces erlenmeyer de 100 ml.
- Válvulas de Müller.
- Placas de petri.
- Asa de siembra.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Mosto comercial.
- Ácido sulfúrico.
- Medio agar-malta.
- Sacarosa.
- Cultivo de levadura 48 horas.
Procedimiento:- Prepara medio de cultivo
agar-malta y esterilízalo en autoclave.
- Prepara tantas placas con este medio, como levaduras pretendas ensayar.
- Realiza una siembra en estría con cada levadura e incúbalas
durante 48 horas a 28 ºC.- Coge tantos matraces erlenmeyer como levaduras vayas a ensayar, sabiendo que debes de hacerlo por duplicado.
- Tapa los matraces con algodón y papel de aluminio y esterilízalos en el horno pasteur a
160 ºC durante 1 hora.- Partiendo de mosto comercial
prepara un mosto de 12 ºBe, añadiéndole sacarosa.
- Una vez esterilizados los matraces, añade a cada uno 50 ml exactos del mosto preparado.
- Esterilízalos en autoclave a
121 ºC y 1 atmósfera, durante 15 minutos.
- Tras esterilizar y a temperatura ambiente, inocula cada matraz con una levadura a ensayar. Recuerda que has de hacerlo
por duplicado. Es conveniente que trabajes en la campana de flujo laminar o bajo la protección de la llama de un mechero.
No te olvides de rotular o identificar cada matraz.- Cambia el tapón de algodón y papel de aluminio por una
válvula Müller con ácido sulfúrico concentrado. Esta válvula impide la entrada de oxígeno, aunque permite la salida del dióxido de carbono generado, reteniendo otros compuestos volátiles generados.
- Introduce los matraces en una estufa de cultivo, ajustada a la temperatura a la cual pretendas conocer el poder de fermentación. Puedes favorece el proceso con un agitador de vaivén.
- Pesa cada matraz con medio inoculado y con la válvula.
Esta operación de pesado se repetirá cada día, hasta que la pesada sea constante (se suele hacer durante 21 días).
-
Calcula la diferencia entre la primera y la última pesada.Cálculos:El poder fermentativo se expresa en forma % en volumen de alcohol y se obtiene multiplicando la diferencia de pesada por 2,5.Con los valores obtenidos cada día,
puedes realizar una gráfica para comprobar la
cinética fermentativa de cada levadura. Para ello deberás de calcular la diferencia de pesada cada día y hacer la representación gráfica, poniendo en cordenadas el valor de la diferencia de pesada con respecto al día anterior y en abscisas los días transcurridos. Puedes hacerlo a mano o utilizar cualquier programa de cálculo como Excel u otros.
% alcohol (v/v) = p x 2,5 donde
p es la diferencia entre la primera y última pesada.
TOLERANCIA AL ETANOLEs posible que en algunas zonas de producción no existan muchos problemas de paradas fermentativas, pero en otras zonas españolas y del mundo es una situación frecuente, por lo que es importante conocer esta característica.
Objeto: El objeto de este procedimiento es determinar la tolerancia al etanol de las levaduras de interés enológico, para predecir su comportamiento en las fases finales de fermentación del mosto o su capacidad para la elaboración de vinos de elevada graduación.
Material y Productos:- Tubos de ensayo.
- Pipetas de 10 ml.
- Puntas de pipetas de 1 ml.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Agitador de tubos.
- Medio YEPD.
- Etanol absoluto.
- Parafina.
- Disolución de azul de bromotimol.
- Cultivo de levadura 48 horas.
- Suero Ringer.
Procedimiento:- Prepara
suero Ringer según las instrucciones del fabricante
y llena con 10 mililitros del medio, tantos tubos como levaduras vayas a ensayar y esterilízalos en autoclave a 121 ºC y 1 atmósfera.
- Una vez fríos, inocula los tubos con las levaduras que vayas a ensayar (de cultivo reciente). Puedes homogeneizar en un agitador de tubos y recuerda que es imprescindible que trabajes en atmósfera estéril.
De esta forma obtienes un inóculo de cada levadura.- Prepara el medio líquido YEPD, según las instrucciones del fabricante.
- Ajusta el pH del medio a 7.0 y añade un poco de
azul de bromotimol.- Reparte el medio en frascos de autoclave (5 frascos de 200 mililitros).
- Esteriliza los frascos con el medio en autoclave a
0,5 atmósferas durante 15 minutos.- Una vez esterilizados, deja enfriar hasta
40 ºC y añade a cada frasco las
cantidades de etanol necesarias para conseguir una escala de
9, 12, 15, 18 y 20 % (v/v)de etanol, trabajando en campana.
- Reparte cada frasco en tantos tubos de ensayo como levaduras pretendas ensayar, teniendo en cuenta que debes hacerlo todo por duplicado.
- Añade a cada tubo, en condiciones de esterilidad,
1 mililitro del inóculo de la levadura preparado en suero Ringer. Homogeneiza en el agitador de tubos.
- Cubre los tubos con
parafina líquida, para generar ambiente de anaerobiosis.
- Incúbalos en la estufa de cultivo a
28 ºC durante 3 días.Si el indicador añadido al medio, azul de bromotimol, vira de verde a naranja, indica que la levadura está viva y es capaz de seguir reproduciéndose.Por lo tanto tolera el porcentaje de etanol existente en ese medio.
Puedes realizar un
recuento diario de células en el microscopio, utilizando una cámara de
Thoma o
Neubauer y expresando el resultado en número de células por mililitro, para ver su evolución con el paso de los días.
FLOCULACIÓNDentro de los conceptos relacionados con los coloides de los vinos, una forma de evitar los posibles problemas generados por su presencia, es conseguir que se agreguen formando partículas de mayor tamaño y así poder eliminarlas por sedimentación o por filtración.
Se conoce como floculación al fenómeno de agregación de los coloides del vino y los agregados generados son conocidos como flóculos.
Es por ello, que resulta interesante conocer si una levadura tiene carácter floculante.
Objeto: El objeto de este procedimiento es determinar el
carácter floculante de una levadura de interés enológico, como característica importante en los procesos fermentativos.
Material y Productos:- Matraces erlenmeyer de 100 ml.
- Pipetas 10 ml.
- Autoclave.
- Estufa de cultivos.
- Medio YEPD.
- Cultivo de levadura de 48 horas.
Procedimiento:- Prepara medio líquido YEPD y repártelo en matraces erlenmeyer limpios, añadiendo 35 mililitros a cada matraz.
- Tápalos con algodón y papel de aluminio o con un tapón específico para microbiología.
- Esterilízalos en autoclave a 0,5 atmósferas durante 15 minutos.
- Inocula cada levadura en un matraz, operando en ambiente estéril, partiendo de los cultivos recientes de las mismas y utilizando un asa de siembra.
- Recuerda que debes de hacer el ensayo por duplicado.
- Incuba los matraces a
28º C sobre un agitador de vaivén,
durante 48 horas.- Una vez pasado el período de incubación se realizan las observaciones siguientes:
- Una observación macroscópica para comprobar la formación de flóculos.- Una observación microscópica para comprobar la formación de agregados celulares.
Interpretación de los Resultados: La aparición de flóculos, es una característica que no es muy fácil de encontrar.
BACTERIAS DE INTERÉS ENOLÓGICOLas levaduras y las bacterias son microorganismos unicelulares, y existen diferencias entre una célula bacteriana y una levadura. Por eso es imporante conocer las características diferenciales entre células eucariotas y procariotas.
En el entorno de la producción vitivinícola, existe un determinado número de bacterias cuyo conocimiento es imprescindible para poder elaborar un vino con unas garantías mínimas de éxito.
Estas
bacterias de interés enológico, se dividen desde un punto de vista práctico, en:
- Bacterias Lácticas: Se trata de un grupo de bacterias que están presentes en las vendimias y en los vinos, que tienen la capacidad de desarrollarse o no hacerlo, según las condiciones del medio. En la mayoría de las ocasiones
generan alteraciones y defectos en la elaboración, por lo que es imprescindible poner los medios necesarios para evitar su formación.
También existen procesos en los que las bacterias lácticas realizan un
papel positivo, tal y como ocurre en la
fermentación maloláctica, durante la cual las bacterias degradan el ácido málico para producir ácido láctico y disminuir así la acidez del vino.
Las mismas especies de bacterias lácticas son capaces de producir unas u otras transformaciones, pudiendo degradar determinados substratos en función de las condiciones del medio. - Bacterias Acéticas: Son
microorganismos aerobios que pueden producir
importantes alteraciones en vendimias y en los vinos.
También estas bacterias pueden tener una aplicación tecnológica positiva, que en este caso está relacionada con la elaboración de vinagres como productos derivados de la industria vitivinícola.
Salvo en el caso de elaboración de vinagres, las bacterias acéticas son un problema en las bodegas y otras instalaciones enológicas y su presencia debe de evitarse a toda costa.
- Otras Bacterias: Además de las bacterias lácticas y acéticas, en los vinos pueden aparecer otras bacterias aerobias, como algunas especies de
Bacillus, que
producen alteraciones en los vinos dulces.Otras bacterias de alteración son las
Zymomonas, que son
bacterias anaerobias facultativas, que pueden producir fermentaciones de azúcares produciendo etanol, pero que también
producen sulfuro de hidrógeno o acetaldehído.BACTERIAS LÁCTICASLas bacterias lácticas constituyen un grupo heterogéneo que presenta unas características generales comunes a todo el grupo, como son:
- Gram +. Catalasa (-), no producen espuma al mezclarlas con agua oxigenada.
- No forman esporas.
Son anaerobias facultativas.- Fermentan azúcares en diversas condiciones.
- Su morfología puede ser en forma redondeada (cocos) o alargada (bacilos).
Debido a que los mostos y los vinos presentan un pH ácido y con una composición nutritiva determinada, en estos medios nos podemos encontrar un número limitado de especies de bacterias lácticas. Además de los condicionantes mencionados, en el caso del vino
el etanol también restringe las especies, pues no todas soportan más de un 10 % de etanol.
Las especies de bacterias lácticas de interés enológico pertenecen a cuatro géneros:
- Lactobacillus.- Leuconostoc.- Oenococcus.- Pediococcus.Estas bacterias pueden fermentar los azúcares dando origen a diferentes compuestos, ya que las bacterias lácticas homofermentativas producen más del
85 % de ácido láctico a partir de la glucosa, mientras que las heterofermentativas, además de ácido láctico producen otros compuestos como el
ácido acético y el
etanol.
En el cuadro de la imagen adjunta se enumeran las principales bacterias lácticas de interés enológico y el isómero de ácido láctico que produce.
Como carácter diferenciador, debemos de tener en cuenta las siguientes morfologías:
El género
Lactobacillus tiene forma de bastoncillo. Son heterofermentativos.
El género
Pediococcus son cocos agrupados en parejas o en tétradas, pero
nunca forman cadenas.Los géneros
Oenococcus y
Leuconostocse caracterizan por formar
cocos agrupados en parejas y más frecuentemente en pequeñas cadenas.
Se desarrollan en anaerobiosis facultativa.Oenococcus oeni es el principal responsable de la fermentación maloláctica en los vinos.
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICASLas bacterias tienen un tamaño que puede oscilar entre los 0,5 y los 3 micrómetros, lo que significa que son mucho más pequeñas que las levaduras y esta circunstancia dificulta mucho su observación.
Normalmente es necesario recurrir a preparaciones teñidas para lograr una mejor observación, por lo que es conveniente conocer los procedimientos de observación.
Los mostos, vinos y uvas constituyen medios naturales en los que las bacterias lácticas coexisten con mohos, levaduras y bacterias acéticas. Por lo tanto, para su estudio es necesario recurrir a
técnicas específicas que garanticen un cultivo puro.
Los medios de cultivo más utilizados para bacterias lácticas son el Rogosa, el Elliker o el MRS en presencia de
nistatina (inhibe crecimiento de levaduras) y
cristales de difenilo (inhibe crecimiento de mohos).
Procedimiento:- Si partes de una muestra de mosto, puedes realizar una
primera selección por centrifugación, eliminando así las levaduras. Una segunda centrifugación del líquido sobrenadante, origina un precipitado bacteriano con el que puedes preparar una serie de diluciones decimales para realizar un cultivo.
- Prepara el medio de cultivo y esterilízalo en autoclave siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Vierte en las placas el medio trabajando en ambiente estéril. Si es posible en campana de flujo laminar.
- Antes de que solidifique el medio, inocula con 1 ml de cada una de las diluciones decimales.
- Introduce las placas solidificadas en una
jarra de anaerobiosis, en cuyo fondo se introduce un sobre con un secuestrante de oxígeno y una tira indicadora.
- Incuba a 30 ºC durante 48 horas.
- Una vez transcurrido el tiempo de incubación,
realiza el recuento de colonias y expresa el resultado en ufc/ml, teniendo en cuenta la dilución.
- Sobre un portaobjetos prepara un frotis con inóculos de las colonias obtenidas en el cultivo.
- Realiza todo el proceso de
tinción de Gram.- Observa al microscopio las preparaciones y toma nota de la morfología de las bacterias lácticas.
Interpretación de los Resultados: Las bacterias lácticas son Gram positivo, por lo que aparecerán teñidas de azul violáceo.
Pueden aparecer células en forma redondeada (cocos) correspondientes a
Oenococcus o más o menos alargadas (bacilos) correspondientes a
Lactobacicllus.
En caso de partir de un vino que presenta una alteración de origen bacteriano, como el
ahilado, la
vuelta o el
amargor, es posible distinguir las bacterias causantes de la alteración, por su morfología o mediante pruebas bioquímicas.
LAS BACTERÍAS ACÉTICASAlguna vez habaras escuchado la expresión “este vino está picado” o “este vino tiene vinagre” y las responsables de esta alteración son las bacterias acéticas.
Las bacterias acéticas pertenecen a dos géneros:
- Acetobacter: Bacterias que son capaces de
oxidar el
ácido láctico y el
ácido acético, hasta dar anhídrido carbónico. Dentro de este género se encuentran especies como: Acetobacter aceti, Acetobacter pastorianus, y otras. Se caracterizan por su
capacidad para oxidar el etanol originando acetato de etilo o ácido acético.- Gluconobacter: Bacterias que
no oxidan el
ácido láctico ni el
ácido acético y que comprende varias especies. Dentro de este género se encuentran especies como Gluconobacter oxydans y otras. Se caracterizan por la
oxidación de los azúcares para originar
compuestos cetónicos y
ácido glucónico.
Morfológicamente las bacterias acéticas presentan
una forma redondeada o alargada (cocobacilares), con un tamaño comprendido entre (0,6 a 0,8) x (1.0 a 4,0) micrómetros, encontrándose aislados, o bien
agrupados en parejas o en cadenas de cierta longitud. A menudo agrupadas en forma de ocho. Algunas especies presentan flagelos hacia el exterior, que en unos casos rodean la totalidad de la célula, mientras que en otros están presentes sólo en los extremos. Estos cilios permiten que la célula se pueda mover por sí mismas en el medio.
Al igual que las bacterias lácticas,
se multiplican por escisión y no forman esporas.El metabolismo de las bacterias acéticas es estrictamente aerobio, por lo que normalmente se desarrollan en la superficie del vino.Cuando el medio, el vino en este caso, tiene una cantidad suficiente de oxígeno disuelto, podemos encontrar bacterias acéticas en el seno del mismo. De ahí que sea necesario controlar
la
cantidad de oxígeno disuelto que contienen los vinos, de cara a prevenir los ataques de bacterias acéticas.
La estructura celular es también muy similar a la de las bacterias lácticas, diferenciándose únicamente en la estructura de la pared celular, razón por la cual
la
tinción de Gram es negativa.Las bacterias acéticas son muy sensibles al SO2 por lo que en los vinos que están sulfitados de una manera correcta no suelen presentar la alteración del avinagrado.Cuando un vino empieza a picarse es posible que tan solo se detecte mediante cata, ya que su aspecto no varía. Cuando la enfermedad se encuentra más avanzada, se genera turbidez con aparición de un velo en la superficie de aspecto liso y grisáceo y que posteriormente forma pliegues. En ocasiones al engrosarse el velo, cae en forma de discos, aunque en estos casos ya estamos hablando de vinagre más que de vinos.
En el viñedo, estas bacterias son más frecuentes y abundantes en las uvas atacadas por
Botrytis cinerea que en uvas sanas.
CULTIVO Y OBSERVACIÓN DE BACTERIAS ACÉTICASUn vino podría servirnos como medio de cultivo para bacterias acéticas, siempre que no contenga sulfitos y que su graduación alcohólica no sea muy elevada (mejor sobre 10 grados). Pero existen otros medios preparados, que optimizan el crecimiento de estas bacterias y que por lo tanto, ahorran tiempo de espera en el laboratorio.
Los medios más utilizados para el cultivo de estas bacterias acéticas son el medio Williamson y el Agar diferencial WL.
Si quieres obtener inóculos para iniciar un cultivo de bacterias acéticas, puedes partir de un vino con picado acético incipiente o de un vino en el que el picado acético está ya más avanzado. Por supuesto que si partimos de un vinagre, será mucho más sencillo obtener muestras con suficientes bacterias para el cultivo.
Procedimiento:Muestreo:- En el caso de partir de un vino con ataque incipiente, deberás de llenar 2 ó más tubos de centrífuga, recordando que es necesario que pongas números pares, para no desequilibrar el rotor de la centrífuga. A continuación centrifuga a 6000 rpm durante unos minutos. Vierte con cuidado el líquido sobrenadante y mediante un asa de siembra estéril toma un inóculo de la fracción depositada en el fondo.
- Si partes de un vino con picado acético avanzado o de un vinagre, toma directamente el inóculo del velo superficial, formado por las bacterias acéticas.
- También puede tomar un volumen de líquido y realizar una serie de diluciones decimales con agua de peptona o suero Ringer.
Cultivo:- Prepara medio el de cultivo (Agar diferencial WL o medio Williamson).
- En un ambiente de esterilidad, vierte el medio en las placas, dejando solidificar y eliminando el agua de condensación.
- Toma el inóculo de la muestra con un asa estéril e inocula las placas, realizando un aislamiento por estría, para obtener colonias bien separadas.
- Si partes de las diluciones decimales, realiza una siembra por vertido, mezclando 1 ml de cada dilución con el medio a 45 ºC y deja enfriar hasta solidificación.
- Incuba en condiciones de aerobiosis durante 72 horas a 28-30 ºC.
- Observa a las 24, 48 y 72 horas.
Observación:- En las placas que has sembrado por vertido puedes hacer un recuento del número de colonias y expresar el resultado en ufc/ml .
- Puedes observar la movilidad de las bacterias acéticas en una preparación en fresco.
- Para observar la morfología de las bacterias acéticas, realiza una extensión sobre un portaobjetos y sométela a un proceso de tinción de Gram.
- Observa al microscopio siguiendo el procedimiento anteriormente explicado.
Interpretación de los resultados:- En el agar diferencial pueden aparecer colonias de bacterias acéticas del género
Acetobacter y
Gluconobacter.
- Al realizar la observación de la
movilidad de las bacterias del género
Acetobacter, éstas
presentan flagelos peritricos (distribuidos por todo el perímetro celular), mientras que las del género
Gluconobacter presentan
flagelos polares.- Al observar la preparación con tinción, se observan
células cocobacilares coloreadas con una tonalidad entre rosa y rojizo, típica de los Gram negativos, aisladas y también agrupadas en pares o en pequeñas cadenas.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA BODEGA Y EL MATERIAL VINARIOLa elaboración del vino depende de un proceso en el que la intervención microbiana es indispensable. Y además de los microorganismos responsables de este proceso, existe otro buen número de ellos cuya presencia no es deseable, por dar origen a
alteraciones y
defectos en los vinos elaborados.
Las bodegas, los equipos y materiales propios de estas instalaciones, son
reservorios en los que los microorganismos pueden sobrevivir durante mucho tiempo, por lo que las medidas de higienización y desinfección de los mismos, son fundamentales para lograr un ambiente controlado desde el punto de vista microbiológico. De no ser así, es posible que estos microorganismos interfieran en el proceso de elaboración obteniendo resultados diferentes a los esperados.
Por lo tanto, el control microbiológico de las instalaciones y materiales de la bodega es indispensable para que el proceso de elaboración se sitúe dentro de los parámetros previstos.
Para llevarlo a cabo, debemos de tener en cuenta las siguientes fases de control:
- Control de Paredes y Suelos: Las características constructivas, tipos y calidad de los materiales empleados, es un requisito legal regulado cuyo objetivo es facilitar los procesos de limpieza y desinfección.
Además de suelo y paredes propiamente dichos, debemos de considerar también los elementos existentes en ellos, como pueden ser desagües, ventanas, ventiladores etc.
- Control del Material Vinario y las Conducciones: Todos los equipos que van a estar en contacto con las uvas, mostos y vinos, deberán de garantizar que no presentan una población microbiana que pueda interferir en el proceso de elaboración. El protocolo habitual determina el proceso de lavado y desinfección del material tras su uso, pero en ocasiones, unas malas condiciones de almacenamiento facilitan la presencia de microorganismos no deseables. Por esta causa es necesario volver a limpiar y desinfectar antes de su uso, así como controlar la eficacia de la desinfección.
- Control del Agua Utilizada en la Bodega: A pesar de que debe de existir un sistema que garantice que el agua utilizada en las bodegas es potable, resulta aconsejable realizar un control periódico de la eficacia del sistema potabilizador.
El agua puede ser un vehículo de numerosos microorganismos, algunos de los cuales pueden ser patógenos y afectar incluso a la salud del personal que trabaja en la bodega.
CONTROL DE SUPERFICIES Y MATERIAL VINARIOLos microorganismos también están presentes en las paredes y suelos de las instalaciones enológicas, existiendo una población microbiana habitual, formada por hongos, levaduras y bacterias aerobias, generalmente Gram positivas, aunque también Gram negativas.
Control de Suelos y Paredes: Para garantizar que los procesos de elaboración de los vinos no se vean afectados por esta población microbiana, suelen existir una serie de protocolos de buenas prácticas que incluyen los sistemas de limpieza y desinfección de cada tipo de local, en función de cuál sea su uso.
Desde el punto de vista de análisis microbiológico, las pruebas de control de la calidad microbiana de suelos y paredes, se limitan a verificar la eficacia de los protocolos mencionados.
Aunque para verificar el proceso de limpieza y desinfección de una bodega u otra instalación enológica, puedes recurrir a diferentes métodos de control, es recomendable recurrir a procedimientos simples y que no requieran un equipamiento sofisticado. Un ejemplo de este tipo de procedimientos puede ser el que se expone a continuación.
- Muestreo y recuento de bacterias aerobias, hongos y levaduras antes de la limpieza.
- Aplicación del protocolo de limpieza y desinfección, especificando los productos que se utilizan, así como las dosis empleadas.
- Muestreo y recuento de bacterias aerobias, hongos y levaduras después de la limpieza.
Para el muestreo y análisis de las superficies, puedes proceder como sigue:
- Elabora una plantilla cuadrada de cartón o plástico, de
10 X 10 cm a modo de marco.
- Preparar los siguientes medios de cultivo: PCA para recuento de microorganismos aerobios, agar VRB para recuento de coliformes totales y medio Sabouraud para hongos y levaduras.
- Selecciona diferentes partes de la pared o suelo y pon sobre ellas el marco delimitador de 10 X10 cm.
- Mediante un
hisopo previamente humedecido durante 2 minutos en 9 ml de suero Ringer o caldo base TAT (es un medio enriquecido), frota en dirección horizontal y vertical hasta cubrir toda la superficie delimitada por el marco.
- Agita el hisopo en los 9 mililitros de solución de suero Ringer o caldo base TAT.
-
Inocula con 0.1, 1 y 2 ml de esta solución 3 placas de petri estériles. Añade el medio PCA a 45 ºC, agita con suavidad y deja que se solidifique.
- Repite el proceso con el medio agar VRB y lo mismo con el medio Sabouraud.
- Incuba las placas de PCA y VRB a 35-37 ºC durante 48 horas y las placas con Sabouraud a 25 ºC durante 5 días.
- Realiza el recuento en la dilución que permita contar
entre 30 y 300 ufc/ml.- Expresa los resultados en unidades formadoras de colonias por unidad de superficie (ufc/cm2).
Control del Material Vinario y las Conducciones: Para el control del material destinado al procesado y almacenamiento del vino, es necesario que
controles la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección al igual que en paredes y suelos.
Pero ocurre que en algunos equipos y conducciones, existen numerosos puntos de difícil acceso, en los cuales la población microbiana es más abundante, siendo estos puntos los que deberás de muestrear para el control microbiológico. Algunos ejemplos pueden ser los
codos de las conducciones, las
zonas de soldadura de los depósitos,
los acoples de alimentación de los filtros y bombas y todos aquellos que creas que pueden albergar microorganismos.
Para su control puedes recurrir a los mismos sistemas que para paredes y suelos, siendo el método más recomendable la utilización del
hisopo humedecido. CONTROL DEL AGUAEs necesario que los responsables del control de calidad de la bodega realicen el control microbiológico del agua. Depende de los casos. Ya que si el suministro de agua potable proviene de un pozo o manantial propio, sí que es su responsabilidad y deberá de establecer un protocolo de potabilización y control del proceso. También es cierto y bastante frecuente, que esta tarea se contrate a una empresa especializada.
Por otro lado, en la mayoría de las bodegas el agua se suministra a través de la red pública de abastecimiento de agua potable, por lo que el control de la calidad microbiológica de la misma, corresponde al organismo o empresa suministradora.
Aún así, tanto en un caso como en el otro, es conveniente realizar un control periódico en la bodega para corroborar que los parámetros de potabilidad se ajustan al protocolo establecido.
Para este control, se suele recurrir a un muestreo en los puntos de abastecimiento y encargar el análisis a un laboratorio acreditado para este tipo de determinaciones. A nivel interno puedes recurrir a métodos de filtración o a los numerosos kits existentes en el mercado.
Antes de realizar el muestreo debes de limpiar y desinfectar el grifo por flameado y dejar verter posteriormente un poco de agua y utiliza un frasco estéril de plástico o vidrio para recoger la muestra.
Etiqueta el frasco con fecha, hora y punto de muestreo, siendo recomendable anotar también el nombre de la persona que realizó el muestreo.
Traslada la muestra al laboratorio lo antes posible. De no ser así consérvala en un frigorífico o nevera portátil, hasta el momento del traslado o el análisis.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL VINO Debido a la enorme variabilidad en los procesos de elaboración y envasado de los vinos, no se pueden dar unas pautas específicas para llevar a cabo el control microbiológico en las distintas etapas, por lo que se describen una serie de
ideas generales que nos ayudan a tomar las decisiones en cada caso concreto.
Para poder establecer y organizar
un protocolo general de control microbiológico del vino, debemos de analizar cada una de las fases del proceso de elaboración, estudiando cuál es la
carga microbiana presente, que parte de la misma es beneficiosa y cuál no lo es y en que momentos puede aumentar o disminuir el valor de esta carga.
Por lo tanto deberemos establecer sistemas de control en las siguientes fases o etapas:
- Control Durante el Proceso de Elaboración: Desde que la uva entra en la bodega hasta que el vino está preparado para su envasado, generalmente en botellas, existen numerosos puntos en los que la población microbiana puede sufrir modificaciones tanto en su composición como en su concentración, por lo que será necesario prever todas las posibilidades, evitando así sorpresas, poco o nada deseables. En cada fase del proceso el objetivo de control será diferente y acorde a la población microbiana presente. Así se establecen los siguientes controles:
- Control de la Materia Prima.- Control de la Fase de Procesado de las Uvas.- Control de la Fermentación Alcohólica.- Control de la Fermentación Maloláctica.- Control de la Fase de Crianza- Control Durante el Envasado del Vino: Cuando el vino llega a esta fase, se supone que está listo para su envasado y por lo tanto con una carga microbiana acorde a los parámetros que aseguren su estabilidad. En algunos casos, en el momento del embotellado y formando parte del proceso, el vino se somete a una filtración amicróbica a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Este proceso supone una reducción importante de la población, pero no una eliminación total.
Por otro lado, los equipos de envasado se componen de una serie de partes que pueden contribuir al incremento de la carga microbiana, en caso de no estar perfectamente limpios.
- Control del Producto Final: Una vez que el vino está envasado, ya no hay posibilidad de modificar su calidad microbiológica.
De todas formas la tecnología actual, permite envasar en total ausencia de oxígeno, lo que no permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aunque estuvieran presentes. No ocurre lo mismo con los anaerobios.
Aún así, la posibilidad de conocer la
carga microbiana del producto envasado, nos ayudará a prever el comportamiento y las posibles evoluciones del mismo.
CONTROL DURANTE EL PROCESO DE ELABORACIÓN- Control de la Materia Prima: El control microbiológico del proceso de elaboración, se inicia con el control de la materia prima.
Un mosto recién obtenido
es una buena muestra para observar la presencia de levaduras y todos los microorganismos presentes en las uvas. La observación microscópica es un parámetro indicador para poder evaluar la calidad microbiana del mosto, a la vez que puedes comprobar la eficacia del proceso de sulfitado, siempre y cuando realices la observación o el recuento antes y después de efectuarlo. Tras el sulfitado no deberías de observar la presencia de
bacterias acéticas ni lácticas.- Control de la Fermentación Alcohólica: Durante el proceso de fermentación resulta interesante realizar observaciones diarias de las levaduras, realizando recuento de las mismas (con cámara de recuento al microscopio) y observando la evolución de las poblaciones y su
tasa de multiplicación.Se trata de contribuir a la prevención de posibles paradas fermentativas, ya que si la población de levaduras se mantiene activa y con una tasa de multiplicación suficiente, existirá una baja probabilidad de que ocurra.
Este tipo de control microbiológico no es usual en las bodegas, ya que son momentos de mucho trabajo y el seguimiento de la fermentación se hace mediante la
evolución de densidades o parámetros fisicoquímicos. Aún así, ante la aparición de alteraciones del proceso, las técnicas microbiológicas resultan útiles para ayudar a detectar y solucionar las posibles
causas de la alteración.- Control de la Fermentación Maloláctica: Entre el final de la fermentación alcohólica y el principio de la maloláctica, existe un
periodo de riesgo de contaminación por otro tipo de bacterias y levaduras, siendo
Bretanomyces una de las posibles. Esta levadura origina una serie de compuestos cuya presencia en el vino es muy preocupante, por lo que es importante realizar un control para evitar males mayores.
Para ello existen en el mercado
kits rápidos de filtración y cultivo en medios específicos que delatan la presencia de esta levadura de contaminación.
Al iniciarse la fermentación maloláctica, las levaduras dejan paso a las bacterias lácticas.
La observación y cultivo de la población microbiana presente en el vino durante la fermentación maloláctica, debiera de confirmar la
predominancia de
Oenococcus oeni, aunque también aparecerán otras bacterias.
Debido a que las condiciones necesarias para esta fermentación requieren una temperatura suave y bajo contenido de dióxido de azufre, es conveniente observar la posible presencia de
bacterias acéticas. Para ello deberás de realizar observaciones al microscopio de forma periódicas y realizar cultivos en medios selectivos.
Una vez finalizada esta fermentación, los vinos se suelen limpiar y sulfitar con dosis que garanticen la estabilidad microbiana. Además, la temperatura de conservación también suele ser baja, por lo que la actividad microbiana es menor.
- Control de la Fase de Crianza: Durante esta fase el vino está en contacto con la madera y en ocasiones con lías procedentes de la fermentación. En este caso, la presencia de microorganismos alteradores procedentes de la propia madera o presentes en el vino, como
bacterias lácticas y
acéticas o levaduras tipo
Bretanomyces, pueden alterar de forma irreversible el proceso de crianza.
Por ello es recomendable realizar un control de la población microbiana periódicamente, pudiendo para ello recurrir a las técnicas de observación directa al microscopio o a la filtración por membrana y posterior cultivo.
CONTROL DURANTE EL ENVASADODurante la fase de envasado, el vino llega a esta fase con una carga microbiana determinada. Durante el envasado, se puede reducir esta carga mediante una filtración amicróbica previa, pero también se puede incrementar si las condiciones higiénicas de los equipos utilizados no son las adecuadas. Por ello es necesario realizar un control de estas dos fases del proceso.
Si un vino es sometido a una filtración amicróbica de
0,45 micrómetros (micras), su carga microbiana se reduce notablemente, mientras que si el vino no se somete a este tipo de filtración, la población microbiana presente en el vino será mayor y más diversa que en los vinos filtrados. Esta circunstancia nos obliga a realizar un control estricto sobre esta carga y comprobar el
nivel de sulfuroso molecular presente después del embotellado, para asegurar así la estabilidad del vino.
Hay que comprobar la eficacia del equipo de filtración para garantiza la ausencia de microorganismos.
- Control de la Eficacia del Filtro Amicróbico: Aunque los vinos hayan pasado por un filtro amicróbico, debes de saber que es posible que contengan aún una carga microbiana determinada, compuesta sobre todo por
bacterias acéticas.Estas bacterias pueden provocar un incremento de la
acidez volátil. Por ello es recomendable realizar un control de población microbiana antes y después de la filtración amicróbica.
Para realizar este control debes de proceder como sigue:
- Prepara placas con los medios de cultivo YEPD + tetraciclina para levaduras, MRS para bacterias lácticas y medio diferencia WL para bacterias acéticas.
- Toma muestras del vino que vas a embotellar antes y después de la filtración amicróbica.
- Realiza una serie de diluciones decimales con cada muestra.
- De cada dilución realiza una siembra por vertido placa, tomando 1 mililitro y sembrando una placa de cada uno de los medios.
- Incuba a 28 ºC de 2 a 7 días.
- Realiza el recuento en la placa más representativa y anota el resultado del número de ufc/ml, teniendo en cuenta la dilución.
- Control de los Equipos de Embotellado: El proceso de embotellado en las bodegas, se lleva a cabo mediante equipos más o menos sofisticados y cuya composición es muy variable.
Aunque la tendencia actual es la de fabricar equipos muy versátiles, con posibilidad de adaptarse con facilidad a diferentes tipos de botellas o a rendimientos más o menos elevados, es necesario que tengas en cuenta que para garantizar la seguridad microbiológica del vino embotellado, la persona responsable del proceso deberá de realizar un
exhaustivo control microbiológico del mismo.
El embotellado es el último eslabón del control microbiológico en el proceso de elaboración del vino. El control del equipo de embotellado, debes de realizarlo después de completar el proceso de limpieza y desinfección del mismo, tanto si usas agentes antimicrobianos y posterior lavado con agua como si lo haces tan solo con agua muy caliente.
Los puntos a controlar son aquellos que están en
contacto con el vino, como interior del depósito de almacenamiento,
boquillas de llenado,
sistema de aforado o
niveladores y tubo de taponado.
El sistema más rápido de control es mediante uso de
hisopos estériles y suero Ringer, placas de contacto o
laminocultivos, existiendo en el mercado algunos modelos con doble cultivo (uno a cada lado) que permiten realizar un fácil recuento de bacterias y levaduras, tras el cultivo.
CONTROL DEL PRODUCTO ACABADOUna vez que el vino está embotellado, ya no es posible aplicar ninguna medida que modifique la
calidad microbiológica del vino. Aún así y aunque no existe ninguna norma reguladora sobre la calidad microbiana de los vinos embotellados, para asegurar su durabilidad es necesario que comprobemos cuáles son los valores de
ufc/ml del producto acabado, pues de ello depende que el vino se conserve en buenas condiciones en la botella o por lo contrario que presente alguna alteración.
Para determinar la carga microbiana de un vino embotellado, podemos recurrir a numerosas técnicas rápidas instrumentales, pero éstas son caras y no suelen formar parte del laboratorio de una bodega.
Por ello es preferible que nos familiaricemos con los métodos de
filtración por membrana desarrollados por Millipore y otras casas comerciales, que nos permitirán realizar el control de una manera sencilla y no muy costosa.
El procedimiento para su realización es el siguiente:
- Prepara el equipo de filtración con embudos estériles de vidrio o plástico desechable.
- Coloca una membrana estéril de 0,45 micras y añade al embudo 100 mililitros del vino a analizar.
- Aplica vacío al equipo hasta que filtre la totalidad del vino.
- Rompe el vacío y retira el embudo.
- Con una pinza flameada
retira el filtro y colócalo, con el retículo hacia arriba, en una placa petri con medio de cultivo específico para levaduras, bacterias acéticas o bacterias lácticas. También puedes utilizar medios genéricos que permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos.
- Incuba a 28ºC entre 24 y 72 horas. (Recuerda que para las bacterias lácticas debes de incubar en anaerobiosis).
- Realiza un recuento de las colonias formadas y expresa el resultado en ufc/ml.
La calidad microbiológica del vino embotellado dependerá tanto de la cantidad de microorganismos encontrados, como de la especie o especies a las que pertenezcan.En efecto, en ocasiones la presencia de una pequeña cantidad de células de
bacterias lácticas heterofermentativas, es más preocupante que una mayor tasa de
bacterias homofermentativas, debido a que su presencia puede dar origen a compuestos no deseables.
GESTIÓN DE RESIDUOS DE MICROBIOLOGÍASegún las definiciones de residuos y normas generales de gestión de los mismos: En el laboratorio de microbiología enológica no se generan residuos que supongan un peligro potencial para la salud humana.
Aún así, el hecho de trabajar con microorganismos vivos, implica un especial cuidado a la hora de gestionar los residuos, pues aunque no sean microorganismos
patógenos, pueden tener influencia sobre los sistemas productivos.
Lo primero a tener en cuenta para una correcta gestión, es procurar la
minimización de los residuos generados, para lo cual es importante:
- Llevar un riguroso control de todo lo que se adquiere, ya que a la larga se convertirá en residuo.
- Comprar según las necesidades, evitando el deterioro o caducidad de los productos o materiales, generando residuos innecesariamente así como gastos económicos.
- Reutilizar o reciclar estos productos y materiales siempre que sea posible.
En el laboratorio de microbiología enológica, se generan residuos tipificados como:
- Asimilables a Urbanos: Son aquellos que aun siendo generados en un laboratorio,
no presentan necesidades especiales de gestión, salvo la necesidad de realizar una selección y clasificación de los mismos para favorecer la recogida selectiva. Se incluye el papel de secar las manos, botellas de vidrio o plásticas de muestras, envoltorios, etc.
- Residuos Químicos: Se generan residuos clasificados en el grupo II, en el que se encuadran los disolventes no halogenados como el alcohol etílico y metílico, acetona, xilol y otros.
También
se generan residuos químicos del grupo III, disoluciones acuosas de ácidos y bases, colorantes y fijadores, para cuya gestión deberás de seguir el procedimiento general de almacenamiento y gestión por empresa especializada.
- Material de Vidrio Contaminado: Que se rompe en el laboratorio, no debe de ser depositado en el contenedor de vidrio habitual, depositándose en un contenedor específico adecuado. Es importante reseñar que el
vidrio roto contaminado con productos químicos (pipetas, probetas, vasos y otro material de laboratorio en general), presenta riesgos vinculados a los riesgos intrínsecos de los productos químicos que lo contaminan y, además, el riesgo de daños por vía parenteral, debidos a cortes o pinchazos.
- Material de Cultivo Desechable: Como se ha comentado anteriormente, a pesar de que en un laboratorio enológico no se trabaja con microorganismos patógenos, todo el material que estuvo en contacto con cultivos de microorganismos y no se vaya a reutilizar,
debe de ser esterilizado antes de depositarlo en los contenedores de basura.
Para ello las placas, tubos y otros utensilios con medio de cultivo, deberán de esterilizarse en autoclave. Una vez pasados por el mismo se deforman totalmente, por lo que deben de gestionarse como
residuos orgánicos asimilables a urbanos.- Botes, Frascos de reactivos y medios: Se gestionarán según el protocolo general, almacenándolos en contenedores etiquetados hasta la recogida por parte de una empresa especializada.
